Koffein utvinning, enzymatisk aktivitet og genuttrykk av koffein syntase fra anlegget celle suspensjoner
Summary
Denne protokollen beskriver en effektiv metode for utvinning og kvantifisering av koffein i cellen suspensjoner av C. arabica L. og en eksperimentell prosess for evaluering av den enzymatiske aktiviteten av koffein syntase med hvilket uttrykk genet som kodes dette enzymet.
Abstract
Koffein (1,3,7-trimethylxanthine) er et purine alkaloid i populære drikker som kaffe og te. Denne Sekundær metabolitt er ansett som en kjemisk forsvar fordi det har antimikrobielle aktivitet og regnes som en naturlig insektmiddel. Koffein kan også produsere negative allelopathic effekter som hindrer vekst av rundt planter. I tillegg bruker mennesker over hele verden koffein for sin smertestillende og stimulerende. På grunn av interesse for den teknologiske anvendelser av koffein, har forskning på den biosyntetiske sti av dette sammensatte vokst. Disse studiene har primært fokusert på å forstå de biokjemiske og molekylære mekanismene som regulerer biosyntesen av koffein. In vitro vev kultur har blitt et nyttig system for å studere denne biosyntetiske veien. Denne artikkelen beskriver en trinnvis protokoll for kvantifisering av koffein og måle transkripsjon nivået av genet (CCS1) koding koffein syntase (CS) i celle suspensjoner C. arabica L. samt sin virksomhet.
Introduction
Koffein er en Sekundær metabolitt som er biosynthesized av planter av slekten Coffea1. Denne alkaloid tilhører methylxanthine familie, og regnes som kjemiske fabrikk forsvar fordi det kan fungere mot de negative effektene av patogener og planteetere2,3. I tillegg er denne metabolitten ansvarlig for egenskapene stimulerende kaffe drikke, som vanlig forbrukt verdensomspennende4,5. På grunn av sine egenskaper, er flere forskningsgrupper interessert i å studere biosyntetiske veien og katabolisme koffein6,7. Foreløpig tjene anlegget i vitro cellen/vev kulturer som et alternativ for å vurdere koffein akkumulering under ulike biotiske og abiotiske strategier8,9.
Koffein biosyntesen innebærer hydrolytisk utgivelsen av 7-methylxanthine fra den tilsvarende ribose nukleosid etterfulgt av bestilte N-methylations posisjoner 3 og 1. En bestemt S– adenosyl metionin (SAM)-avhengige N-methyltransferase (NMT) gir metylering i posisjon 7, mens theobromine syntase (TS) og CS er involvert i den 3 – og 1-methylations, henholdsvis produsere theobromine og koffein. Studiet av gener som koder distinkte NMTs har tillatt forstå mekanismen som regulerer koffein produksjon10,11. CS, som har Nmethyltransferase aktivitet, gir de to siste trinnene av biosyntetiske veien koffein11. I kaffe treet planter, har det vært vist at lys stråling kan øke CS aktivitet, som resulterer i en økning i koffein biosyntesen. Nylig viste vi at vedlikehold av cellen suspensjoner av C. arabica L. under lys bestråling er den optimale tilstanden for evaluering av virkningene som produserer abiotiske stress faktorer påvirker biosyntetiske veien koffein8. Informasjonen i disse studiene kan ha programmer i metabolske engineering og systemer biologi for å maksimere studiet av koffein biosyntetiske veien i slike in vitro -systemer.
Gitt fordelene ved å få en passende modell for studiet av koffein biosyntesen, optimalisert vi utvinning vilkårene for koffein på cellen suspensjoner av C. arabica L. Det var også mulig å utvikle en nyttig protokoll for å studere den enzymatiske aktiviteten samt metodologiske trinn for å vurdere nivået på genet transkripsjoner av Coffea koffein syntase 1 (CCS1) koding Dette enzymet. Her, rapportere vi en protokoll for å trekke ut og kvantifisere koffein i C. arabica celle suspensjoner av tynne lag kromatografi og densitometry (TLC-densitometry).
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer her de optimale forholdene for å vurdere koffein innhold, CS aktivitet og transkripsjon nivåer i en i vitro plante vev kultur, for eksempel celle suspensjoner av C. arabica. Tidligere rapporter har bekreftet at opprettholde celler under lys bestråling og i nærvær av theobromine i kultur medium er passende parametere for å øke nivået av koffein, gjør det mulig å evaluere metodene koffein separasjon bruker omvendt-fase høyytelses flytende kromatografi (RP-HPLC). Foreløpig er det…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet med vårt laboratorium ble finansiert av en bevilgning fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) til SMTHS. Denne forskningen ble også støttet av et fellesskap gitt til RJPK (nr. 37938) av CONACyT og Sistema Nacional de Investigadores (4422). Forfatterne takker CIATEJ for bruk av installasjonene under skriving av dette manuskriptet. Spesiell takk er utvidet til Dr. Víctor Manuel González Mendoza for alle anbefalinger i molekylærbiologi delen og Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM for fasiliteter under filmingen av denne artikkelen.
Materials
| Murashige & Skoog Basal salt mixture | PhytoTechnology Laboratories | M524 | Packge Size: 50 L Reagent (mg/L) Ammonium Nitrate (1650) Boric acid (6.2) Calcium chloride, anhydrous (322.2) Cobalt Chloride•H2O (0.025) Cupric Sulfate•5H2O (0.025) Na2EDTA•2H2O (37.26) Ferrous Sulfate•7H2O (27.8) Magnesium Sulfate, Anhydrous (180.7) Manganese Sulfate•H2O (16.9) Molybdic Acid (Sodium Salt)• 2H2O (0.25) Potassium Iodide (0.83) Potassium Nitrate (1900) Potassium Phosphate, Monobasic (170) Zinc Sulfate•7H2O (8.6) Supplemented with myo-inositol (100) thiamine (10) cysteine (25) sucrose (30000) 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (3) 6-benzylamine purine (1) |
| Caffeine | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Theobromine | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Planar Chromatography Manager software | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Isoamyl alcohol (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Cyclohexane | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetone | J.T. BAKER | 900643 | 4 L |
| Methanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Chloroform | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | TLC plate |
| β-mercaptoethanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-sodium L- ascorbate | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Hydrochloric acid 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 | 2.5 L |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 232227 | Kit |
| Methyl [3H]-S-adenosyl methionine | Perkin Elmer | NET155 | Specific activity of 15 Ci/mmol |
| Liquid scintillation vials | SIGMA | Z253081 | |
| Thermostatic bath/circulator | Cole Parmer | 60714 | |
| Micro centrifugue tube | Eppendorf | Tube of 1.5 mL | |
| Cryogenic vials | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 mL |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Porcelain mortar | Fisherbrand | FB961B | |
| Filter paper | Whatman | Z274844 | Porosity medium |
| Picofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Analytical balance | AND | HR-120 | Model HR-120 |
| Scintillation counter | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel photodocumentation system | Bio-Rad | Chemic XRS | Model Chemic XRS |
| Compact UV lamp | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Buchner funnel | SIGMA | 2419907 | Type 37600 mixer |
| TRIzol reagent | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Reverse transcriptase | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µM |
| DNase I, RNase-free | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Magnesium chloride | Thermo scientific | EN0525 | 1.25 mL |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | For 200 reactions of 25 µL |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Phenol, pH 8.0, equilibrated, Molecular Biology Grade, Ultrapure | USB | J75829 | 100 mL |
| Isopropyl alcohol | Karal | 2040 | 1 L |
| Ethyl alcohol | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Diethyl pyrocarbonate | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Lab Rotator | LW Scientific | Mod. LW210 |
References
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, &. #. 3. 8. 1. ;. Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sledz, W., Los, E., Paczek, A., Rischka, J., Motyka, A., Zoledowska, S., Lojkowska, E. Antibacterial activity of caffeine against plant pathogenic bacteria. Acta Biochimica Polonica. 62 (3), 605-612 (2015).
- Lipton, R. B., Diener, H. C., Robbins, M. S., Garas, S. Y., Patel, K. Caffeine in the management of patients with headache. Journal of Headache and Pain. 18 (1), 1-11 (2017).
- De Mejia, E. G., Ramirez-Mares, M. V. Impact of caffeine and coffee on our health. Trends in Endocrinology & Metabolism. 25 (10), 489-492 (2014).
- Uefuji, H., Tatsumi, Y., Morimoto, M., Kaothien-Nakayama, P., Ogita, S., Sano, H. Caffeine production in tobacco plants by simultaneous expression of three coffee N-methyltrasferases and its potential as a pest repellant. Plant Molecular Biology. 59 (2), 221-227 (2005).
- Denoeud, F., Carretero-Paulet, L., Dereeper, A., Droc, G., Guyot, R., Pietrella, M., Aury, J. M. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science. 345 (6201), 1181-1184 (2014).
- Kurata, H., Matsumura, S., Furusaki, S. Light irradiation causes physiological and metabolic changes for purine alkaloid production by a Coffea arabica cell suspension culture. Plant Science. 123 (1-2), 197-203 (1997).
- Pech-Kú, R., Muñoz-Sánchez, J. A., Monforte-González, M., Vázquez-Flota, F., Rodas-Junco, B. A., González-Mendoza, V. M., Hernández-Sotomayor, S. T. Relationship between aluminum stress and caffeine biosynthesis in suspension cells of Coffea arabica L. Journal of Inorganic Biochemistry. 181, 177-182 (2018).
- Huang, R., O’Donnell, A. J., Barboline, J. J., Barkman, T. J. Convergent evolution of caffeine in plants by co-option of exapted ancestral enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (38), 10613-10618 (2016).
- Mizuno, K., Okuda, A., Kato, M., Yoneyama, N., Tanaka, H., Ashihara, H., Fujimura, T. Isolation of a new dual-functional caffeine synthase gene encoding an enzyme for the conversion of 7-methylxanthine to caffeine from coffee (Coffea arabica L.). FEBS letters. 534 (1-3), 75-81 (2003).
- Kato, M., Mizuno, K., Fujimura, T., Iwama, M., Irie, M., Crozier, A., Ashihara, H. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves. Plant Physiology. 120 (2), 579-586 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Method. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kurata, H., Achioku, T., Furusaki, S. The light/dark cycle operation with an hour-scale period enhances caffeine production by Coffea arabica cells. Enzyme and Microbial Technology. 23 (7-8), 518-523 (1998).
- Sartor, R. M., Mazzafera, P. Caffeine formation by suspension cultures of Coffea dewevrei. Brazilian Archives of Biology Technology. 43 (1), 1-9 (2000).
- Koshiro, Y., Zheng, X. Q., Wang, M. L., Nagai, C., Ashihara, H. Changes in content and biosynthetic activity of caffeine and trigonelline during growth and ripening of Coffea arabica and Coffea canephora fruits. Plant Science. 171 (2), 242-250 (2006).
- Schimpl, F. C., Kiyota, E., Mayer, J. L. S., de Carvalho Gonçalves, J. F., da Silva, J. F., Mazzafera, P. Molecular and biochemical characterization of caffeine synthase and purine alkaloid concentration in guarana fruit. Phytochemistry. 105, 25-36 (2014).
- Perrois, C., Strickler, S. R., Mathieu, G., Lepelley, M., Bedon, L., Michaux, S., Privat, I. Differential regulation of caffeine metabolism in Coffea arabica (Arabica) and Coffea canephora (Robusta). Planta. 241 (1), 179-191 (2015).
