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Biochemistry

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

Published: August 20, 2018 doi: 10.3791/58167
Automatic Translation
1,2,3, 2, 1,3, 3, 2, *4, *1,3
1Center for Applied Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Munich University of Applied Sciences, 2FG Protein Biochemistry & Cellular Microbiology, Munich University of Applied Sciences, 3Center for Nano Science, Ludwig-Maximilians-Universität München, 4Klinik für Unfallchirurgie, Orthopädie und Plastische Chirurgie, University Medical Center Göttingen
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल सिलिकॉन के लिए एक heterobifunctional silane युग्मन एजेंट के साथ प्रोटीन के आबंध स्थिरीकरण का वर्णन-ऑक्साइड सतहों परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए डिज़ाइन किया गया है जो द्वारा उदाहरण है fibronectin के साथ RrgA ( एस. निमोनिया के pilus-1 टिप adhesin) की बातचीत ।

Abstract

हाल के वर्षों में, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM) आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (SMFS) आणविक संपत्तियों और कार्यों की हमारी समझ को बढ़ाया. यह हमें करने के लिए एक भौतिक तंत्र की बहुलता का पता लगाने का अवसर दिया, जैसे, कैसे बैक्टीरियल adhesins और अधिक विस्तार में सतह रिसेप्टर्स की मेजबानी के लिए बाध्य । अंय कारकों के अलावा, SMFS प्रयोगों की सफलता ठोस सतहों और AFM सुझावों पर ब्याज की कार्यात्मक और देशी के स्थिरीकरण पर निर्भर करता है । यहां, हम सिलिकॉन के लिए प्रोटीन का आबंध युग्मन के लिए एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन silane-खूंटी-carboxyls और अच्छी तरह से स्थापित N-hydroxysuccinimid/1-एथिल-3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimid (EDC/ स्ट्रेप्टोकोकस मैट्रिक्स प्रोटीन extracellular (एफ एन) के साथ ग्राम पॉजिटिव जीवाणु fibronectin निमोनिया (एस निमोनिया) से pilus-1 adhesin RrgA की बातचीत का पता लगाने के लिए । हमारे परिणाम बताते है कि सतह functionalization कांच की सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है और AFM ब्रैकट टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता के लिए, SMFS के दौरान बातचीत की घटनाओं के 20% तक के लक्ष्य मूल्य से स्पष्ट माप और पता चला कि RrgA बांध ५२ pN का मतलब बल के साथ एफ एन के लिए । प्रोटोकॉल साइट विशिष्ट मुक्त thiol समूहों के माध्यम से जोड़े को समायोजित किया जा सकता है । एक पूर्वनिर्धारित प्रोटीन या अणु अभिविंयास में यह परिणाम है और SMFS के अलावा अंय भौतिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है ।

Introduction

ऑप्टिकल और चुंबकीय चिमटी के बगल में, परमाणु बल माइक्रोस्कोप (AFM)1,2 एक उपयोगी उपकरण के रूप में उभरा है विश्लेषण और अणुओं में हेरफेर और उनके गुण और कार्य, बाहरी बल 3 के लिए अपनी प्रतिक्रिया सहित उनकी जांच ,4. एंजाइम लिंक्ड immunosorbent परख (एलिसा), सतह plasmon अनुनाद (SPR) या क्वार्ट्ज क्रिस्टल microbalance (QCM) setups जैसे तरीकों के विपरीत, AFM एकल अणु (SMFS)5 और एकल कोशिका स्तर (SCFS) 6 पर बातचीत को मापने के लिए अनुमति देता है . इन प्रौद्योगिकियों पकड़ बांड की तरह बाध्यकारी तंत्र में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि उपज ई. कोलाई pilus प्रोटीन FimH mannose के साथ7, या मिलकर β-जिपर एस aureus से एफ एन बाध्यकारी प्रोटीन द्वारा गठित दोहराता के साथ बातचीत के लिए मिला 8एफ एन के लिए बाध्यकारी पर । हम हाल ही में यह दिखाने में सक्षम थे कि pilus-1 adhesin RrgA9,10 ग्राम से पॉजिटिव जीवाणु स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया (S. निमोनिया)11 को fibronectin12 में बांध कर अपने दो टर्मिनल डोमेन के साथ । यह एक नया दो डोमेन बाइंडिंग प्रणाली है जो मिलकर β-जिपर से अलग है और piliated pneumococci सक्षम करने के लिए फार्म और fibronectin युक्त मेजबान13सतहों के लिए एक क्षणिक संपर्क बनाए रखने के लिए कर सकते है पता चला ।

SMFS प्रयोगों की सफलता ठोस सतहों और AFM सुझावों पर कार्यात्मक और गैर-अणुओं के देशी स्थिरीकरण पर निर्भर करता है । के रूप में उच्च बलों SMFS माप के दौरान हो सकता है, प्रोटीन अधिमानतः सतह के लिए युग्मित किया जाना चाहिए covalently । वहां प्रोटीन और अंय जैव अणुओं के स्थिरीकरण के लिए विभिंन युग्मन तरीकों की एक बड़ी संख्या में हैं, साथ ही साथ पूरी कोशिकाओं पर (अकार्बनिक) ठोस सतहों, नैनो कणों और अंय साहित्य में वर्णित उपकरणों14,15 ,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25,26,27. इन प्रोटोकॉल अक्सर खतरनाक पदार्थों का उपयोग करने के लिए, प्रदर्शन और/या विशेष उपकरण (जैसे, प्लाज्मा क्लीनर) की आवश्यकता है मुश्किल कर रहे हैं । कांच के लिए कुछ अणुओं के लिए एक सरल तरीका है एक तरफ एक silane-प्रतिक्रियाशील समूह और उनके दूसरे पक्ष पर एक अमीन-प्रतिक्रियाशील समूह के साथ heterobifunctional crosslinkers का एक मोटा बहुलक परत संलग्न है । आवेदन पर निर्भर करता है, युग्मन एजेंटों लचीला हाइड्रो चर लंबाई के कार्बन श्रृंखला, जैसे, polyethylenglycol (खूंटी) शामिल कर सकते हैं । वे संशोधित सतहों के गैर विशिष्ट बातचीत को दबाने (जैसे, hydrophobic, इलेक्ट्रोस्टैटिक और वान-डेर-Waals बातचीत) और युग्मित अणु रोटेशन स्वतंत्रता प्रदान कर सकते हैं ।

यहां, हम एक या एक से अधिक मुक्त अमीनो समूहों (-NH2) युक्त प्रोटीन की आबंध युग्मन के लिए एक सामांय प्रोटोकॉल का वर्णन कांच सतहों और सिलिकॉन नाइट्राइड AFM युक्तियां एक heterobifunctional ethoxy silane-खूंटी-carboxyl (-COOH) के माध्यम से । इस प्रोटोकॉल SMFS प्रयोगों, जो RrgA और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन एफ एन के संपर्क के आधार पर उदाहरण है में इस्तेमाल किया जा सकता है (एक सिंहावलोकन के लिए 1 चित्र देखें) ।

पहला कदम सतह28,29,30,31के silanization है । यह युग्मन एजेंट के ethoxy समूहों के hydrolysis के क्रम में उच्च प्रतिक्रियाशील SiOH समूहों के रूप में शामिल है । इन सब्सट्रेट पर SiOH समूहों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं । एक प्राथमिक संघनित्र कदम में, इन silanols फार्म हाइड्रोजन बांड और सब्सट्रेट पर फैल गया । एक माध्यमिक संघनित्र प्रतिक्रिया में (जो आम तौर पर गर्मी या निर्वात के लिए पानी निकालने की आवश्यकता है), siloxane बांड का गठन कर रहे हैं । यह एक covalently संलग्न organo-silane परत में परिणाम है ।

दूसरे चरण कार्यात्मक (-COOH) समूहों जो बहुलक३२से विस्तार करने के लिए प्रोटीन के युग्मन है । सबसे पहले, एसिड एक प्रतिक्रियाशील N-hydroxysuccinimid (एन एच एस) एस्टर मध्यवर्ती, जो अच्छी तरह से स्थापित एन एस सी के माध्यम से प्राप्त की है (1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid रसायन विज्ञान३३ और बहोत nucleophilic प्रतिस्थापन करने के लिए परिवर्तित हो जाता है अंत में प्रोटीन पर प्राथमिक अमीन के साथ एक के बीच संबंध बनाने के लिए ।

इस तरह, RrgA एक यादृच्छिक अभिविंयास में सिलिकॉन नाइट्राइड AFM युक्तियां और ग्लास सब्सट्रेट करने के लिए मानव एफ एन के लिए युग्मित किया गया था और उनके संपर्क बलों एकल अणु स्तर पर विश्लेषण किया गया । हमारे परिणाम बताते है कि वर्णित सतह रसायन विज्ञान के कांच की सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है और टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता के लिए, SMFS माप के दौरान बातचीत की घटनाओं के 20% तक के लक्ष्य मूल्य से स्पष्ट है । इस रसायन विज्ञान गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि बातचीत कम कर देता है, डेटा अधिग्रहण के दौरान थोड़ा परिवर्तन के अधीन है और इसलिए उत्कृष्ट सटीक SMFS प्रयोगों के लिए अनुकूल है ।

Protocol

1. कार्यात्मक Silane युग्मन एजेंटों के माध्यम से प्रोटीन का स्थिरीकरण

नोट: चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल में लागू की सतह रसायन विज्ञान पर एक सिंहावलोकन देता है.

चेतावनी: निंनलिखित प्रोटोकॉल में, संक्षारक और त्वचा परेशान गुण के साथ विभिंन रसायनों का इस्तेमाल कर रहे हैं । पहनने के लिए पर्याप्त (एसिड-प्रतिरोधी) दस्ताने, सुरक्षा चश्मे, और प्रयोगशाला कोट और धुएं के हुड के तहत काम करते समय समाधान की तैयारी के लिए वाष्पों की साँस लेना से बचने के लिए ।

  1. silane युग्मन एजेंटों के साथ कांच सतहों और सिलिकॉन नाइट्राइड ब्रैकट के Functionalization
    1. isopropanol और एक प्रकार का वृक्ष के साथ कांच स्लाइड से मोटे धूल और प्रदूषित निकालें-मुक्त परिशुद्धता पोंछे और इच्छित आकार में स्लाइड (वैकल्पिक) काट दिया ।
      नोट: कांच के बगल में, ठोस सतह सिलिका, क्वार्ट्ज, और एल्यूमीनियम, तांबा, टिन, टाइटेनियम, लोहा, क्रोमियम, zirconium, निकेल, और जस्ता के आक्साइड हो सकता है ।
      चेतावनी: कांच की स्लाइड्स काटना तेज किनारों का कारण हो सकता है ।
    2. कांच की स्लाइड्स को एक धुंधला जार में रखें हाइड्रोक्लोरिक अम्ल (३३% HCl) से भरे हुए दुगना आसुत जल (ddH2O) से 3-5% (v/v) उचित ढक्कन के साथ जार बंद करें और यह एक अल्ट्रासोनिक स्नान में कमरे के तापमान पर ९० मिनट के लिए जगह है ।
      नोट: इस्तेमाल किया जार 6 सेमी और 65-70 मिलीलीटर की एक अनुमानित आकार का एक व्यास है । जार के लिए पतला एचसीएल का एक उपयुक्त वॉल्यूम ५० एमएल युक्त 5 एमएल ३३% एचसीएल और ४५ एमएल ddH2ओ का है । एचसीएल प्रभावी रूप से गैर बाध्यकारी धातु आयनों, विशेष रूप से सोडियम, पोटेशियम, और कैल्शियम को हटा और एक हाइड्रॉक्सिल संतृप्त कांच की सतह का उत्पादन करने के क्रम में सिलिकॉन कम कर देता है ।
      चेतावनी: एचसीएल संक्षारक और त्वचा परेशान है । पर्याप्त एसिड-प्रतिरोधी दस्ताने, सुरक्षा चश्मे और प्रयोगशाला कोट और धुएं के हुड के नीचे काम पहनते हैं, जबकि समाधान की तैयारी के लिए वाष्पों की साँस लेना से बचने के लिए ।
    3. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ टिप के साथ एक साफ गिलास स्लाइड पर सिलिकॉन नाइट्राइड AFM ब्रैकट जांच प्लेस और ऊपर से कम से ९० मिनट के लिए अल्ट्रा वायलेट प्रकाश के साथ विकीर्ण ।
      नोट: एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए, ०.०१ के एक नाममात्र के वसंत स्थिरांक के साथ cantilevers ०.१ N एम-1 के लिए उपयुक्त हैं । यूवी प्रकाश के साथ ब्रैकट सतह के विकिरण कार्बनिक पदार्थों, मुख्य रूप से वसा पदार्थों को दूर करेगा, और यह एक तरफ हाइड्रोफिलिक प्रदान करते हैं । यदि दूसरी ओर भारी दूषित है-जो मामला नहीं होना चाहिए, या यदि ब्रैकट जांच ' आपूर्तिकर्ताओं बॉक्स से बाहर ताजा उपयोग किया जाता है-यह SMFS माप को प्रभावित कर सकते हैं । पिरांहा समाधान है, जो कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है का उपयोग कर पूरी ब्रैकट चिप की एक पूरी तरह से सफाई३४, मदद मिल सकती है ।
      चेतावनी: यूवी प्रकाश आंखों के लिए हानिकारक है; इसलिए, ब्रैकट जांच के विकिरण एक यूवी प्रकाश अभेद्य चैंबर में किया जाना चाहिए । पिरांहा समाधान अत्यधिक प्रतिक्रियाशील है और त्वचा, कागज और अंय कार्बनिक सामग्री जला सकता है । प्लास्टिक के कंटेनरों का प्रयोग न करें । अगर (उदाहरणके लिए, पिछले उपयोग से) कार्बनिक सतह संदूषणों की छोटी मात्रा के साथ भी बर्तन या जार में रखा, यह तेजी से प्रतिक्रिया कर सकते हैं ।
    4. कांच की सतह सूखी दे और एक और 10 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक स्नान में वापस जार जगह के बिना ddH2ओ के साथ धुंधला जार में हाइड्रोक्लोरिक एसिड की जगह । पानी दो बार 10 मिनट के लिए क्रमशः ठीक से हाइड्रोक्लोरिक धो बदलें एसिड.
    5. इस बीच, भंग ethoxy (या methoxy) silane पॉलीथीन ग्लाइकोल एसिड (एसआई (ओसी2एच5)3-खूंटी-COOH) इथेनॉल और ddH2ओ के मिश्रण में (वी/v 95%/5%, पीएच ४.६ एसिटिक एसिड के साथ समायोजित) ०.१ मिलीग्राम मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए -1. स्टोर समाधान hermetically आदेश में इथेनॉल के वाष्पीकरण से बचने के लिए बंद कर दिया ।
      नोट: Silane युग्मन एजेंटों नमी और तापमान के प्रति संवेदनशील हैं । इसलिए, वे निष्क्रिय गैस (एन2), कम तापमान पर (-20 डिग्री सेल्सियस) और शुष्क परिस्थितियों में संग्रहित किया जाना चाहिए । कुप्पी खोलने से पहले, सुनिश्चित करें कि silanes हाइड्रेट को कम करने के लिए कमरे के तापमान तक पहुँच चुके हैं और इस प्रकार प्रतिक्रियाशील समूहों की passivation. Heterobifunctional खूंटी युग्मन एजेंटों कई अलग कार्यात्मक समूहों और अलग स्पेसर लंबाई के साथ उपलब्ध हैं । अपने मुक्त अमीनो समूहों (एनएच2) के माध्यम से प्रोटीन के बेतरतीब स्थिरीकरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, कार्यात्मक ethoxy/methoxy silane के लिए अतिरिक्त समूह एक एन एच एस एस्टर होना चाहिए । एन एच एस एस्टर, एक सरल तरीका है ऐसे एन एच एस एस्टर लाभ के साथ एक silane एजेंट की खरीद के बगल में 1-एथिल-3-(3 dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) और एन एच एस के साथ एक carboxyl समूह (-COOH) सक्रिय है (देखें 1.2.1. and 1.2.2.) ।
      चेतावनी: इथेनॉल ज्वलनशील और त्वचा परेशान है । एसिटिक एसिड ज्वलनशील और संक्षारक है । त्वचा पर या आंखों में प्रतिक्रियाशील silanes प्राप्त करने के लिए नहीं ध्यान रखना । पर्याप्त दस्ताने पहनें, सुरक्षा चश्मे और प्रयोगशाला कोट और धुएं डाकू के तहत काम करने के लिए वाष्प की साँस लेना से बचने के लिए.
    6. दो अलग पेट्री व्यंजन में silane समाधान डालो, तैयार ब्रैकट जांच और ग्लास स्लाइड एक पेट्री डिश में क्रमशः जगह, सील hermetically (जैसे, parafilm) इथेनॉल और ९० मिनट के लिए मशीन स्थिर के वाष्पीकरण से बचने के लिए कमरे का तापमान ।
      नोट: पेट्री डिश का इष्टतम आकार ब्रैकट जांच की संख्या और कांच स्लाइड जो कार्यात्मक किया जाना चाहिए के आकार पर निर्भर करता है । अच्छा हैंडलिंग और कम एजेंट मात्रा के लिए एक व्यास का आकार 50-60 mm है । ब्रैकट के अवांछित झुकने से बचने के लिए जबकि हवा पानी अंतरफलक के माध्यम से मर्मज्ञ ब्रैकट हवा में एक ९० ° कोण पर आयोजित किया जाना चाहिए पानी इंटरफ़ेस । कांच स्लाइड की मशीन (लेकिन ब्रैकट जांच नहीं) वैकल्पिक रूप से एक कक्षीय शेखर पर किया जा सकता है ।
    7. ब्रैकट और ग्लास स्लाइड शुद्ध इथेनॉल युक्त तीन लगातार यूरिन में पूरी तरह से बंद असीम silane यौगिकों धोने के लिए कुल्ला ।
      नोट: एयर वॉटर इंटरफेस के माध्यम से मर्मज्ञ जबकि ब्रैकट के अवांछित झुकने से बचने के लिए, ब्रैकट एक ९० ° कोण पर आयोजित किया जाना चाहिए.
    8. धुंधला जार में कार्यात्मक ग्लास स्लाइड प्लेस और एक साफ गिलास स्लाइड पर ब्रैकट और इलाज ११० ° c पर 30 मिनट के लिए ।
      नोट: गर्मी के साथ इलाज आबंध siloxane बांड और पानी की हटाने के गठन लाती है । कांच स्लाइड केवल एक तरफ कार्यात्मक थे के रूप में, ठीक से लेपित पक्ष का संकेत करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    9. silanized ग्लास नमूनों और ब्रैकट जांच एक वैक्यूम desiccator में एक सप्ताह के लिए स्टोर ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  2. silanized ग्लास और सिलिकॉन नाइट्राइड ब्रैकट पर प्रोटीन की यादृच्छिक स्थिरीकरण
    नोट: ब्रैकट के अवांछित झुकने से बचने के लिए, ब्रैकट जांच एक ९० ° कोण पर आयोजित किया जाना चाहिए, जबकि किसी भी हवा पानी इंटरफेस मर्मज्ञ ।
    1. एक समाधान तैयार EDC के ४२ मिलीग्राम एमएल-1 और 20 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 मानक फॉस्फेट में एन एच एस खारा (पंजाबियों; १३७ mm NaCl, २.७ mm KCl, 10 mm Na2HPO4, १.८ mm KH2पीओ4, पीएच ७.४) ।
      चेतावनी: EDC संक्षारक और त्वचा परेशान है और गंभीर आंख नुकसान का कारण बन सकता है । पर्याप्त दस्ताने, सुरक्षा चश्मे और प्रयोगशाला कोट पहनते हैं ।
    2. समाधान के साथ silane लेपित ग्लास स्लाइड को कवर और EDC/एन एच एस समाधान की एक बूंद में silanized ब्रैकट जांच रखो और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: ब्रैकट जांच की मशीन के लिए, मूल ब्रैकट बॉक्स उपयुक्त है । heterobifunctional silane-खूंटी एजेंटों के carboxyls (-COOH) के लिए अपने मुक्त अमीनो समूहों के माध्यम से दंपति प्रोटीन के लिए,-COOH समूह व्यापक रूप से इस्तेमाल EDC/एन एच एस रसायन विज्ञान के साथ सक्रिय है । EDC जोड़ों carboxylic एसिड के लिए एन एस, एक "स्थिर" एन एच एस एस्टर जो शारीरिक पीएच में प्राथमिक अमीन के लिए एक अगले कदम में कुशल विकार सक्षम बनाता है गठन ।
    3. तीन लगातार यूरिन में पंजाबियों के साथ ब्रैकट और कांच की स्लाइड्स को अच्छी तरह से कुल्ला करें ताकि अत्यधिक EDC/
      नोट: यह धुलाई कदम शेष EDC के रूप में महत्वपूर्ण है/एन एच एस प्रोटीन crosslink कर सकते है और इस तरह उनकी कार्यक्षमता में परिवर्तन ।
    4. के साथ और कमरे के तापमान पर एक गीले कक्ष में वांछित प्रोटीन समाधान की एक छोटी बूंद में ब्रैकट जांच के साथ सक्रिय कांच स्लाइड । प्रोटीन एकाग्रता और मशीन समय प्रयोग की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए । सामांय में, ०.५ के बीच एक एकाग्रता 1 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 और 30 मिनट के लिए 2 घंटे से मशीन समय सबसे प्रोटीन के लिए उपयुक्त हैं । fibronectin के मामले में (ग्लास स्लाइड पर) और pilus-1 टिप प्रोटीन RrgA (ब्रैकट पर), १.५ दाढ़ एम और 3 µ एम के एक µ एकाग्रता, क्रमशः, और 2 एच के एक मशीन समय पर्याप्त हैं ।
    5. कांच की स्लाइड्स को धोकर और ब्रैकट जांच के लिए तीन लगातार यूरिन में पंजाबियों के साथ अच्छी तरह से unbounded प्रोटीन को धोने के क्रम में ।
    6. tris (hydroxymethyl)-aminomethan के साथ शेष एन एच एस एस्टर संतृप्त-tris बफर खारा (टीबीएस; ५० mm tris, १५० mm NaCl, पीएच ७.६) में जांच रखने के कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ।
      नोट: इस कदम AFM टिप और कांच की कार्यात्मक सतह के बीच प्रोटीन की अवांछित आबंध युग्मन कम कर देता है, क्योंकि Tris के एमिनो समूहों ब्रैकट और सब्सट्रेट सतह पर शेष सक्रिय COOH समूहों के लिए बाध्य कर सकते हैं ।
    7. ग्लास स्लाइड और ब्रैकट जांच को अच्छी तरह से पंजाबियों के साथ धो लें और उंहें अलग पेट्री में इस्तेमाल जब तक पंजाब में शामिल व्यंजन में स्टोर ।
      नोट: नमूनों को नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए और उसी दिन इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

२. परमाणु बल माइक्रोस्कोपी आधारित एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी

नोट: इस काम में, JPK उपकरणों से एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया गया था और बल-दूरी curves प्राप्त करने के लिए सेट अप बल RampDesigner के साथ परिभाषित किया गया था.

  1. थर्मल शोर विधि३५ के साथ ब्रैकट अंशांकन
    नोट: ब्रैकट अंशांकन के लिए, निर्माता के मैनुअल में चरण का पालन करें । अधिकांश ब्रैकट आपूर्तिकर्ताओं राज्य एक अनुमानित स्प्रिंग स्थिरांक, जो आमतौर पर नाममात्र ब्रैकट आकार (लंबाई, चौड़ाई, मोटाई) से गणना की है और इसलिए बहुत विश्वसनीय नहीं है । के रूप में सही वसंत निरंतर महत्वपूर्ण है, यह ब्रैकट अंशांकन बाहर ले जाने के लिए सलाह दी जाती है तपसिल में नीचे वर्णित है और ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता और वसंत स्थिरांक का मतलब मूल्यों का उपयोग करें । यह वोल्ट में ब्रैकट विक्षेपन रिकॉर्ड करने के लिए उपयोगी हो सकता है (V) प्रयोग के दौरान और यह बल (pN) बाद में परिवर्तित, ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता और वसंत लगातार मतलब मूल्यों का उपयोग कर. वसंत लगातार और ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता से पहले और/या प्रयोग के बाद निर्धारित किया जा सकता है, जब तक लेजर स्थिति ब्रैकट पर बदल नहीं है (परिलक्षित लेजर की स्थिति photodiode पर पुनः समायोजित किया जा सकता है) ।
    1. AFM नमूना धारक पर एक साफ, ताजा गिलास स्लाइड ठीक करें और यह पंजाबियों बफर के साथ कवर ।
      नोट: अंशांकन एक कठिन सतह पर किया जाना चाहिए (जैसे, कांच) और वास्तविक प्रयोगों के रूप में एक ही बफर में.
    2. ब्रैकट धारक पर तैयार ब्रैकट जांच फिक्स, यह AFM सिर में जगह और ध्यान से पंजाबियों बफर की एक बूंद के साथ ब्रैकट गीला ।
      नोट: ब्रैकट के गीला सतह तनाव अंशांकन ग्लास स्लाइड पर पंजाबियों बफर में प्रवेश के दौरान प्रदर्शित होने और इस तरह ब्रैकट के अवांछनीय झुकने कम कर देता है ।
    3. धीरे से अंशांकन सतह की ओर ब्रैकट चाल जब तक ब्रैकट पूरी तरह से पंजाबियों बफर में डूब गया है, लेकिन अभी भी अंशांकन सतह से दूर ।
    4. AFM के शीर्ष दृश्य ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें या (यदि उपलब्ध हो) AFM के नीचे उल्टे माइक्रोस्कोप ब्रैकट की पीठ पर AFM के लेजर की स्थिति के लिए । जहां टिप स्थित है के पास ब्रैकट के अंत के पास लेजर स्थान प्लेस ।
      नोट: लेजर स्पॉट ब्रैकट के अंत के करीब स्थित होना चाहिए, लेकिन यह अभी भी पूरी तरह से ब्रैकट पर होना चाहिए । कोई ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप उपलब्ध है, तो दिखाई लेजर डायोड या अवरक्त लेजर डायोड के लिए एक लेज़र डिटेक्टर कार्ड के लिए कागज का एक टुकड़ा का उपयोग करें, यह AFM सिर के नीचे रख दिया और ब्रैकट के किनारे की ओर लेजर स्थान चाल-चिप, जहां cantilevers स्थित हैं , जब तक आप कागज या डिटेक्टर कार्ड पर स्पॉट देखते हैं । तो किनारे करने के लिए लेजर समानांतर ले जाएँ । जब हाजिरी गायब हो जाती है तो वह ब्रैकट बांह पर होती है । रैखिक cantilevers के लिए, स्थान को लीवर आर्म के अंत की ओर ले जाएं जब तक यह कागज पर दिखाई देता है/डिटेक्टर कार्ड और इसे वापस ले जाने तक यह लीवर आर्म पर फिर से (कागज से गायब हो जाता है/ त्रिकोणीय के लिए, ब्रैकट के दो हथियारों के बीच बीच में स्थान जगह और यह ब्रैकट के अंत की ओर ले जाने, जब तक यह कागज से गायब हो जाता है/ जांच करें कि आप ब्रैकट के बीच में ब्रैकट की लंबी धुरी के लिए जगह सीधा ले जाकर ।
    5. प्रतिबिंबित लेजर बीम photodiode के केंद्र में तैनात है कि इस तरह से AFM के चार चक्र डिटेक्टर photodiode की स्थिति को समायोजित करें ।
      नोट: आगे बढ़ने के रूप में इस प्रकार है: डिटेक्टर डायोड के पास माइक्रोमीटर शिकंजा क्षैतिज में और ऊर्ध्वाधर दिशा में डायोड ले जाने के लिए, जब तक सभी चार चक्रों से राशि संकेत अधिकतम है. तो खड़ी दिशा में डायोड कदम, जब तक ऊर्ध्वाधर विक्षेपन संकेत शूंय है, और क्षैतिज दिशा में डायोड कदम, जब तक पार्श्व विक्षेपण संकेत शूंय है । सिलिकॉन नाइट्राइड cantilevers आमतौर पर एक सोने की कोटिंग है और इसलिए थर्मल विस्तार के दो अलग गुणांक के साथ एक bimetal हैं । एक थर्मल बहाव में यह परिणाम (ऊर्ध्वाधर विक्षेपन संकेत में स्पष्ट) विशेष रूप से समाधान में । माप के दौरान इस बहाव को कम करने के लिए, अंशांकन शुरू करने से पहले कुछ मिनट के लिए पूरे सिस्टम equilibrate दें ।
    6. AFM सॉफ्टवेयर में अंशांकन प्रबंधक खोलें और इस प्रकार के रूप में थर्मल शोर विधि के साथ ब्रैकट के ब्रैकट संवेदनशीलता और वसंत स्थिर जांचना ।
    7. ध्यान से सब्सट्रेट सतह दृष्टिकोण और एक बल दूरी वक्र रिकॉर्ड.
    8. इस टिप सब्सट्रेट सतह के साथ संपर्क में है जहां कर्षण बल वक्र, के सबसे तेजी से भाग के लिए एक सीधी रेखा फिटिंग द्वारा एनएम/वी में ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता का निर्धारण । संवेदनशीलता ब्रैकट स्प्रिंग स्थिरांक को pN/एनएम में परिवर्तित करने में सक्षम बनाता है ।
      नोट: retraction वक्र की ढलान पीजो यात्रा दूरी बनामहै photodiode वोल्टेज में परिवर्तन (एनएम में मापा/
    9. ब्रैकट के साथ ब्रैकट के कई थर्मल शोर स्पेक्ट्रा रिकार्ड लगभग १०० µm या अधिक सतह से दूर करने के लिए किसी भी सतह गलन को बाहर करने के लिए ।
    10. थर्मल शोर स्पेक्ट्रा के लिए AFM सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की एक हार्मोनिक थरथरानवाला फिटिंग द्वारा pN/वी में ब्रैकट के वसंत स्थिरांक निर्धारित करें ।
    11. धीरे से ब्रैकट को वापस लेना और उसे हल से निकाल लेना ।
    12. ब्रैकट अंशांकन के लिए प्रयुक्त कांच की सतह के साथ नमूना सतह मैटीरियल प्रोटीन युक्त स्थानापन्न । सुनिश्चित करें कि ब्रैकट और नमूना सतह (और इस तरह के प्रोटीन) सूखी नहीं है, जबकि गिलास स्लाइड बदलते ।
  2. एकल प्रोटीन स्तर पर इंटरेक्शन फोर्स प्रयोग
    1. धीरे से नमूना सतह की ओर नम ब्रैकट चाल जब तक ब्रैकट पूरी तरह से पंजाबियों बफर द्वारा कवर किया जाता है, लेकिन अभी भी सब्सट्रेट सतह से दूर.
      नोट: प्रयोग के दौरान थर्मल बहाव को कम करने के लिए, बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप शुरू करने से पहले पूरे सिस्टम कुछ मिनट के लिए सेट करते हैं ।
    2. सतह और रिकॉर्ड एकाधिक बल दूरी curves (≥ ५००) नमूना सतह के विभिंन स्थानों पर, २५० pN, 1 एस के एक संपर्क समय, 2 µm और 1 µm s-1की एक कर्षण वेग की एक रिकर्षण की लंबाई के एक संपर्क बल के साथ ।
      नोट: सामान्य बल स्पेक्ट्रोस्कोपी समायोजन के लिए, निर्माता के मैन्युअल का पालन करें । रूपांतरों: कर्षण गति ०.१ और 5 µm एस के बीच अलग किया जा सकता है-1 के लिए बढ़ती बल लोड के आधार पर काइनेटिक डेटा की गणना । संपर्क समय निर्भर बांड को मजबूत बनाने के समय का विश्लेषण अलग किया जा सकता है । इसके बजाय कर्षण गति लगातार रखने की, एक बल लगातार रख सकते है (बल दबाना मोड) ।
  3. डेटा विश्लेषण
    नोट: डेटा विश्लेषण डेटा संसाधन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके किया गया था । मैटीरियल प्रोटीन पर निर्भर करता है, संपर्क समय या कर्षण की गति, चाहे एक पदचिह्न या नहीं शामिल किया गया था और अंय चर पैरामीटर, बल दूरी curves कई विभिंन जानकारी शामिल हैं । डेटा विश्लेषण और व्याख्या बहुत अलग SMFS प्रयोगों के बीच भिन्न हो सकते हैं और इसलिए यहाँ विस्तार से वर्णित नहीं किया जा सकता. RrgA और एफ एन के संपर्क के लिए के रूप में, निंनलिखित प्रोटोकॉल SMFS डेटा के विश्लेषण के लिए एक पहला कदम हो सकता है ।
    1. बल स्कैन चिह्न का खुला बैच का चयन करके मापा बल वक्र फ़ाइलें खोलें और बल-दूरी curves प्रक्रिया निम्नानुसार:
    2. ब्रैकट विक्षेपन (वी) सीधे आनुपातिक बल (आरई) का चयन करके संवेदनशीलता और वसंत लगातार आइकन का समायोजन द्वारा वी विक्षेपन जांचना द्वारा परिवर्तित ।
      नोट: ब्रैकट अंशांकन प्रयोग करने से पहले किया गया था, तो मान बल स्कैन फ़ाइलों में सहेजे जाते हैं और स्वचालित रूप से वी-विक्षेपण के अंशांकन के दौरान उपयोग किया जाता है. प्रयोग के बाद अंशांकन किया गया था, तो सॉफ्टवेयर डिफ़ॉल्ट मान है, जो मापा मूल्यों के लिए बदला जा सकता है का उपयोग करता है ।
    3. चिह्न आधार रेखा घटावका चयन करके शून्य बल स्तर सेट करने के लिए सतह से दूर बल वक्र के एक क्षेत्र में कर्षण चैनल के आधार रेखा घटाना ।
      नोट: कुछ मामलों में, retraction एक ही निरंतर बल मान नहीं हो सकता है और वक्र एक रैखिक झुकाव, ऑफसेट + झुकावका चयन करके हटाया जा सकता है जो प्रदर्शित कर सकते हैं ।
    4. बिंदु निर्धारित करें जहां टिप संपर्क बिंदु निर्धारण चिह्न का चयन करके नमूने के साथ संपर्क में हो जाता है ।
    5. टिप- नमूना जुदाई आइकन का चयन करके टिप-नमूना जुदाई के लिए ऊंचाई संकेत कन्वर्ट. संपर्क बिंदु स्थिति को घटाकर करने के अलावा, इस प्रक्रिया सब्सट्रेट सतह और AFM-टिप के बीच की दूरी की गणना करने के लिए झुकने ब्रैकट को घटा ।
      नोट: फिटिंग बहुलक लोचदार मॉडल के लिए, जैसे एक्सटेंसिबल कीड़ा-चेन मॉडल, और बातचीत की लंबाई का निर्धारण, टिप-नमूना जुदाई, जो ब्रैकट झुकने के लिए सही है, की जरूरत है । बल वक्र और z-पीजो वेग की ढलान से बल लदान दर निर्धारित करने के लिए, सही बल घटता इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    6. स्क्रीन बल दूरी ७० एनएम ऊपर टूटना लंबाई पर होने वाली बल चोटियों के लिए (तनी खूंटी स्पेसर की लंबाई)३६ गैर विशिष्ट बातचीत को सुलझाने और चयनित चोटियों के लिए एक्सटेंसिबल कीड़ा तरह श्रृंखला मॉडल का चयन करके लागू करने के लिए एक बहुलक श्रृंखला मॉडल आइकन फिट और एक्सटेंसिबल कीड़ा तरह श्रृंखला मॉडलचुना । कर्षण बल वक्र में चोटियों इस मॉडल और टूटना बलों और लंबाई के साथ सज्जित किया जाएगा प्राप्त कर रहे हैं, एक साथ बहुलक के लोचदार मापदंडों के साथ ।
    7. डेटा को बल और लंबाई वितरण दर्शाने वाले हिस्टोग्राम के रूप में प्रदर्शित करें । हिस्टोग्राम के लिए कम से १०० अनबाइंडिंग ईवेंट्स का उपयोग करें ।

Representative Results

प्रोटोकॉल यादृच्छिक अभिविंयास (चित्रा 1) के साथ उनके सुलभ प्राथमिक अमीन के माध्यम से प्रोटीन के एक आबंध स्थिरीकरण में यहां परिणाम वर्णित है । चित्रा 2 के साथ एक silanized कांच की सतह के एक AFM छवि से पता चलता है (बाएं) और बिना (सही) एफ एन मैटीरियल, नाइट्रोजन की एक सौंय धारा के तहत नमूनों की निर्जलीकरण के बाद दर्ज की गई । silane बहुलक परत लगभग 2-5 एनएम की ऊंचाई के साथ केवल छोटे सतह नालीदार दिखाता है (2 चित्रा, सही), जबकि एफ एन के साथ कार्यात्मक सतह पर, लगभग 10 एनएम उच्च एफ एन अणुओं स्पष्ट (चित्रा 2, बाएं) हैं । बंद अप में, एफ एन के dimeric संरचना पहचाना जा सकता है । एफ एन अणु को खूंटी सतह कोटिंग के ऊपर 4-5 एनएम की ऊंचाई और ~ १२० एनएम की लंबाई के साथ कॉंपैक्ट होने लगते है (आवेषण देखें) ।

एफ एन, जो हाल ही में हमारे13समूह द्वारा विस्तार से वर्णित किया गया था के साथ RrgA के संपर्क बलों की जांच करने के लिए, RrgA एक सिलिकॉन नाइट्राइड AFM टिप और ग्लास सब्सट्रेट करने के लिए मानव एफ एन के लिए युग्मित था (3 ए आंकड़ा) । 1 µm के एक खींच वेग पर दर्ज एफ एन के साथ RrgA की बातचीत के प्रतिनिधि टिप नमूना जुदाई घटता से पता चलताहै 3 चित्रा . प्रयुक्त सतह रसायन विज्ञान एक कम पृष्ठभूमि बातचीत और अच्छी तरह के आकार का एक (या डबल) बातचीत की घटनाओं (3ए), जो श्रृंखला की तरह एक एक्सटेंसिबल कीड़ा (eWLC) मॉडल (लाल curves) का उपयोग फिट थे के लिए नेतृत्व किया । फिट के परिणामों की साजिश रचने (टूटना बल और लंबाई, देखें चित्रा 4) AFM टिप और सब्सट्रेट के बीच गैर विशिष्ट सतह बातचीत पर काबू पाने के बाद पता चलता है कि, और खूंटी linkers खींच (> ७० एनएम), अप करने के लिए ~ 19% के बल curves टूटना दिखाया RrgA के लिए एक मतलब टूटना बल के साथ घटनाक्रम-एक टिप पर ~ ५२ pN के एफ एन बातचीत के बारे में १०० एनएम का नमूना दूरी । इसके विपरीत, एक लागू सतह रसायन विज्ञान (यहां, Tris बफर खारा आंकड़ा 3 बीके साथ शमन लोप) एकल बातचीत की घटनाओं के कारण एक स्पष्ट मूल्यांकन बाधा होगी विशिष्ट बातचीत के लिए, एकाधिक प्रोटीन बाध्यकारी (ट्रेस 2 और 3) और/ आबंध नमूना सतह और AFM ब्रैकट टिप के बीच प्रोटीन के युग्मन । यह उच्च टूटना बलों की ओर जाता है (1 ट्रेस) संभवतः प्रोटीन का खुलासा (एफ एन) डोमेन (4 और 5 का पता लगाने के साथ) ।

Figure 1
चित्रा 1: भूतल रसायन विज्ञान पर सिंहावलोकन । ethoxy silane-खूंटी-carboxyl के hydrolysis हाइड्रेटेड कांच की सतह पर इसके संघनित्र और siloxane crosslinks के गठन के बाद है । carboxyl समूहों के साथ EDC की प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाशील हे-acylisourea, एक अमीन-प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती जलीय समाधान (hydrolysis) में एक अत्यंत कम आधा जीवन के साथ परिणाम है । मध्यवर्ती एक एन एच एस एस्टर जो nucleophilic प्रतिस्थापन के लिए अंत में प्रोटीन पर प्राथमिक अमीन के साथ एक संबंध के रूप में फार्म के गठन से स्थिर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: heterobifunctional ethoxy silane खूंटी carboxyl युग्मन एजेंट के माध्यम से एक गिलास सब्सट्रेट पर fibronectin के स्थिरीकरण. कार्यात्मक कांच की AFM छवियों के साथ सतहों (बाएं) और बिना (दाएं) एफ एन. संख्या व्यक्तिगत एफ एन अणु, जो सब्सट्रेट सतह (आवेषण) पर वितरित homogeneously है संकेत मिलता है । अणुओं खूंटी कोटिंग और > 100 एनएम की लंबाई के ऊपर 4-5 एनएम की ऊंचाई के साथ एक dimeric और कॉंपैक्ट संरचना को अपनाने । यह समाधान में एफ एन की संरचना जैसा दिखता है और अंय सतहों पर पिछले AFM डेटा के अनुरूप है, जैसे, अभ्रक (inlays के पैमाने बार = ५०० एनएम)३७। नीचे AFM छवियों AFM छवियों में संकेत दिया लाइनों के साथ ऊंचाई प्रोफाइल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक SMFS प्रयोग और प्रतिनिधि बल दूरी RrgA-एफ एन बातचीत के curves का चित्रण । (क) RrgA और एफ एन covalently एक सिलिकॉन silane carboxyl नाइट्राइड टिप और एक गिलास सतह, क्रमशः के लिए heterobifunctional ethoxy AFM खूंटी ब्रैकट युग्मन एजेंट के माध्यम से जुड़े थे । प्रतिनिधि SMFS बल दूरी RrgA के लिए प्राप्त-1 µm एस के एक कर्षण वेग में एफ एन बातचीत RrgA और एफ एन के साथ वर्णित स्थिरीकरण दिखाया जाता है । लाल curves एक्सटेंसिबल वर्म की तरह श्रृंखला टूटना बलों और लंबाई प्राप्त करने के लिए लागू फिट बैठता है प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा बेक, एट अल., ACSnano २०१८13से संशोधित किया गया है । (ख) प्रतिनिधि SMFS बल दूरी curves Tris के साथ शमन के बिना RrgA-एफ एन बातचीत के लिए प्राप्त किया । इस मामले में, Tris के प्राथमिक अमीन तो अनुपस्थित था कि शेष सक्रिय एन एच एस एस्टर प्रयोग के दौरान संतृप्त छोड़ दिया गया । यह बहु प्रोटीन बाध्यकारी करने के लिए नेतृत्व (2 और 3 ट्रेस) और सतह और AFM टिप के बीच प्रोटीन की clamping जो उच्च टूटना बलों के परिणामस्वरूप के साथ (एफ एन-) डोमेन खुलासा (ट्रेस 1, 4 और 5; अलग तराजू नोट) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: बल और एकल RrgA की लंबाई वितरण-एफ एन बातचीत । टूटना बल और इसी टूटना लंबाई RrgA-एफ एन SMFS संपर्क मापन (n = १४००) से प्राप्त हिस्टोग्राम 1 µm एस-1के एक कर्षण वेग पर । हिस्टोग्राम एक सबसे संभावित टूटना बल एफ ५१.६ pN केसांसद (गॉस फ़िट, काली रेखा) और १०० एनएम के आसपास टूटना लंबाई का एक संचय प्रकट करते हैं । यह आंकड़ा बेक, एट अल., ACSnano, २०१८13से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

AFM आधारित SMFS की शुरूआत के बाद से, यह एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक में विकसित करने के लिए सीधे व्यक्तिगत प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और अंय अणुओं3,4,5के इंट्रा और आणविक बलों की जांच । सफल SMFS प्रयोगों के लिए, एक उपयुक्त सतह युग्मन रणनीति एक शर्त है । प्राकृतिक और सिंथेटिक पॉलिमर में intramolecular बलों की जांच करने के लिए, पॉलिमर सीधे सब्सट्रेट सतह और AFM टिप३६,३८,३९,४०,४१करने के लिए युग्मित किया जा सकता है । इस तरह के आणविक बांड के रूप में अंतर-आणविक बातचीत, की जांच के लिए, तथापि, यह सलाह दी जाती है कि ऐसे hetero-bifunctional खूंटी लिंकर्स, या पॉलीपेप्टाइड जंजीरों के रूप में लचीला linker अणुओं का उपयोग करने के लिए AFM टिप और बातचीत भागीदारों संलग्न करने के लिए सब्सट्रेट सतह, आदेश में बाध्यकारी भागीदारों के सही अभिविन्यास के लिए अनुमति देने के लिए, कम दूरी की सतह बलों को दूर करने के लिए और विकार से बचने के लिए और प्रोटीन का खुलासा21,22,23, 24,25,26,27,४२. इसलिए हम hetero-bifunctional खूंटी स्पेसिंग का उपयोग कर अपने सुलभ प्राथमिक अमीन के माध्यम से प्रोटीन के आबंध स्थिरीकरण के लिए एक सरल और सीधे आगे प्रोटोकॉल का वर्णन किया ।

हम एस निमोनिया और extracellular मैट्रिक्स प्रोटीन एफ एन से adhesin RrgA के बीच बातचीत बलों की जांच के साथ अपनी प्रयोज्यता का प्रदर्शन किया, के रूप में हाल ही में विस्तार में वर्णित13कहीं ।

भूतल रसायन विज्ञान अच्छी तरह से स्थापित है और विश्लेषण किया गया है और इसी तरह के दृष्टिकोण सफलतापूर्वक एकाधिक SMFS प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है19,४२,४३,४४,४५. silylether सतह के लिए silane बहुलक युग्मन के लिए इस्तेमाल किया, hydrolysis के अधीन है । hydrolysis की डिग्री का गठन siloxane बांड की राशि पर निर्भर करता है, जो silanization प्रक्रिया के दौरान नियंत्रित किया जा सकता है । यदि उच्च संपर्क बलों (≥ १००० pN) SMFS मापन के दौरान की उंमीद कर रहे हैं, silanization भाप के माध्यम से किया जाना चाहिए चरण30 बयान जो siloxanes की एक सतत परत के गठन में परिणाम । कई प्रयोगों के लिए के रूप में (जैसे, कई प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत), संपर्क बलों कुछ सौ pN की सीमा में हैं, और वर्णित प्रक्रिया, जिसमें siloxane गठन एक जलीय चरण और असीम से जमाव से बाहर किया जाता है organo-silanes सोच से इथेनॉल (कदम 1.1.7) गर्मी (कदम 1.1.8) के साथ इलाज के बाद के साथ धोया जाता है, पर्याप्त है ।

एक और महत्वपूर्ण कदम शेष EDC और (1.2.3 कदम) सतह से एन एच एस अणुओं को धो रहा है, के रूप में बचे प्रोटीन पर carboxyl समूहों के सक्रियण के लिए नेतृत्व करेंगे । यह या तो एक ही सतह पर प्रोटीन के crosslinking में परिणाम हो सकता है, जो उनकी कार्यक्षमता या covalently जोड़े को विपरीत सतह पर अंय प्रोटीन के लिए प्रोटीन सक्रिय बदल सकते हैं । यह सतह और AFM टिप है, जो उच्च टूटना बलों में परिणाम संभवतः डोमेन खुलासा के साथ के बीच प्रोटीन की clamping के लिए नेतृत्व कर सकते है (चित्र 3 बी, ट्रेस 1, 4 और 5, एफ एन डोमेन का खुलासा)४६। एक ही समस्या हो सकती है, अगर खूंटी स्पेसर के सक्रिय एन एच एस एस्टर संतृप्त छोड़ दिया जाता है । इसलिए, Tris के साथ मशीन खारा बफर की सिफारिश की है (1.2.6 कदम), Tris के प्राथमिक अमीन के रूप में शेष अमीनो प्रतिक्रियाशील समूहों बुझती है ।

प्रोटोकॉल stepwise के बाद silanized ग्लास सतह पर एफ एन के एक समरूप वितरण की ओर जाता है ( चित्रा 2देखें), प्रोटीन का एक dimeric रूप छोड़ने । इस समाधान में एफ एन ´ एस संरचना जैसा दिखता है और अंय नमूना३७सतहों पर पिछले AFM डेटा के अनुरूप है । इसके अलावा, AFM टिप पर RrgA की एक उचित एकाग्रता प्राप्त की है, जो SMFS माप के दौरान अच्छी तरह से परिभाषित बातचीत की घटनाओं के ~ 20% का एक लक्ष्य मूल्य उत्पंन करता है (चित्रा 3 और चित्रा 4) । एक और सुरुचिपूर्ण तरीका है प्रोटीन एकाग्रता और/या गर्मी के समय अलग करने के अलावा नमूना सब्सट्रेट और ब्रैकट टिप करने के लिए युग्मित अणुओं की राशि को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न माध्यमिक कार्यात्मक समूहों के साथ silane-एजेंटों का संयोजन है । खूंटी-पॉलिमर से विस्तार करने वाले प्रोटीन रिएक्टिव समूहों का अनुपात बदलकर, मैटीरियल प्रोटीन की संख्या15,16,17,18नियंत्रित की जा सकती है ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल भी अन्य-एनएच2 अणुओं से युक्त या कांच और सिलिकॉन नाइट्राइड के अलावा अन्य सिलिकॉन ऑक्साइड सतह के लिए कुछ प्रोटीन के लिए समायोजित किया जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटीन डिजाइन के आधार पर, अमीन प्रतिक्रियाशील carboxyl समूह एक sulfhydryl प्रतिक्रियाशील समूह (जैसे, maleimide या ऑर्थो-pyridyl डाइसल्फ़ाइड) के लिए अपने मुक्त-एसएच समूहों के माध्यम से प्रोटीन दंपति को बदला जा सकता है । एफ एन के लिए, एक पूर्वनिर्धारित अभिविंयास13,17,20में यह परिणाम है ।

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के लिए विभिंन आवश्यकताओं की सेवा समायोजित किया जा सकता है और एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों के अलावा अंय भौतिक अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

टीबी और पारा यूरोपीय अनुसंधान परिषद "Cellufuel, उंनत अनुदान No. २९४४३८" के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं । HCS Innovationsallianz Technofunktionale प्रोटीन (TeFuProt) के माध्यम से शिक्षा और अनुसंधान के लिए संघीय मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है, एसएस विज्ञान और शिक्षा के लिए Bavarian राज्य मंत्रालय से वित्तीय सहायता स्वीकार शोध फोकस के माध्यम से "Herstellung und biophysikalische Charakterisierung dreidimensionaler Gewebe-खिचड़ी" । तकनीकी समर्थन के लिए हम आनाकानी Hasselberg-क्रिस्टोफ और मार्टिना Hörig को धन्यवाद

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
2-Propanol Carl Roth 6752
1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Sigma-Aldrich 03450 EDC
Acetic acid Carl Roth 3738 100 %; analytical purity
Doubly distilled water
Ethanol Carl Roth 9065 ≥ 99.8 %; analytical purity
Ethoxy silane polyethylene glycol acid Nanocs PG2-CASL-5k 5 kDa; COOH-PEG-Si(OC2H5)3
Hydrochloric acid Carl Roth X896 32 %
N-Hydroxysuccinimid Merck 804518 NHS; for synthesis
Phosphate Buffered Saline - Dulbecco Biochrom L1825 PBS
Probe molecule e.g. Fibronectin, human plasma Sigma-Aldrich F1056
Probe molecule e.g. RrgA Produced in laboratory
Sodiumchlorid Carl Roth 9265 NaCl
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan Carl Roth AE15 ≥ 99,3 %; TRIS; Buffer Grade
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Beakers
Glass cutter
Glass slides Carl Roth 0656
Inert gas desiccator Sicco
Inverted Microscope - Zeiss Axiovert 200 Zeiss
JPK NanoWizard 1 JPK Instruments
JPK NanoWizard SPM and DP software JPK Instruments
Laboratory oven Binder
Magnetic stirrer IKA
Micro spatula
Microcentrifuge tubes
Microsoft Excel Microsoft
Parafilm M Brand 701606
Petri dishes
pH-meter Knick
Pipettes Starlab 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl
Precision balance Acculab
Silicon nitride cantilever - MLCT Bruker AXS S.A.S Spring constant ≤ 100 pN/nm
Sonication bath Bandelin
Staining jar
Stereo microscope - Zeiss Stemi Zeiss
Stir bar
Kimtech science precision wipes Kimberly-Clark
Twezzers
UV PenRay UVP, LLC 90-0012-01 Mercury spectrum with the primary energy at 254 nm
Vacuum desiccator
Vacuum pump
Vortex mixer VWR
Weighing paper Carl Roth TP64

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Becke, T. D., Ness, S., Sudhop, S.,… More

Becke, T. D., Ness, S., Sudhop, S., Gaub, H. E., Hilleringmann, M., Schilling, A. F., Clausen-Schaumann, H. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (138), e58167, doi:10.3791/58167 (2018).

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