Forbigående Heterolog ekspression af biosyntetiske enzymer i Nicotiana benthamiana blade kan aflede endogene forsyninger af 2,3-oxidosqualene mod produktion af nye værdifulde triterpene produkter. Heri er beskrevet en detaljeret protokol for hurtig (5 dage) præparativ-skala produktion af Triterpener og analoger udnytte denne kraftfulde plante-baserede platform.
Triterpener er en af de største og mest strukturelt forskellige familier af naturlige planteprodukter. Mange triterpene derivater har vist sig at besidde medicinsk relevante biologiske aktivitet. Dog er hidtil dette potentiale ikke oversat til et utal af triterpen-afledte narkotika i klinikken. Dette er velsagtens (i det mindste delvis) en konsekvens af begrænset praktisk syntetiske adgang til denne klasse af sammensatte, et problem, der kan kvæle udforskning af struktur-aktivitet relationer og udvikling af føre kandidater af traditionelle lægemidler kemi arbejdsprocesser. Trods deres enorme mangfoldighed, Triterpener er alle udledt fra en enkelt lineær forløber, 2,3-oxidosqualene. Forbigående Heterolog ekspression af biosyntetiske enzymer i N. benthamiana kan aflede endogene forsyninger af 2,3-oxidosqualene mod produktion af nye værdifulde triterpene produkter, der ikke naturligt produceret af denne vært. Agro-infiltration er en effektiv og enkel middel forbigående udtryk i N. benthamiana. Processen indebærer infiltration af plante blade med en suspension af Agrobacterium tumefaciens transporterer udtryk construct(s) af interesse. Co infiltration af en yderligere A. tumefaciens stamme bærer et udtryk konstruere kodning et enzym, der øger forløber udbud væsentligt øger udbyttet. Efter en periode på fem dage, kan infiltreret blad materialet høstet og forarbejdet til at udtrække og isolere den resulterende triterpene produkt(er). Dette er en proces, der er lineært og pålideligt skalerbare, simpelthen ved at øge antallet af planter, som anvendes i forsøget. Heri er beskrevet en protokol for hurtig præparativ-skala produktion af Triterpener udnytter denne plante-baserede platform. Protokollen benytter et nemt replikerbar vakuum infiltration apparat, som giver mulighed for samtidige infiltration af op til fire planter, aktivering af batch-wise infiltration af hundredvis af planter i en kort periode.
Triterpener er en af de største og mest strukturelt forskellige familier af naturlige planteprodukter. Trods deres enorme mangfoldighed, er alle triterpene naturprodukter menes at være afledt af den samme lineære forløber 2,3-oxidosqualene, et produkt af den mevalonsyre pathway i planter. Cyclization af 2,3-oxidosqualene er indledt og kontrolleret af en familie af enzymer, der betegnes som oxidosqualene cyclases (OSCs). Denne cyclization skridt repræsenterer det første niveau af diversificering, med hundredvis af forskellige triterpene stilladser har været rapporteret fra naturen1. Disse stilladser er yderligere diversificeret ved at skræddersy enzymer, herunder, men ikke begrænset til, cytokrom p450s (CYP450s)1,2. Sådanne biosyntetiske veje kan føre til enorme kompleksitet, undertiden resulterer i færdige produkter, som er næppe genkendelige fra overordnede triterpene. For eksempel, menes den komplekse struktur af den potent insektbekæmpelsesmidler og antifeedant limonoid azadirachtin at stamme fra en tetracykliske triterpene af tirucallane type3.
Mange triterpene-afledt naturlige produkter, selv dem med forholdsvis uændrede overordnede stilladser, har vist sig at besidde medicinsk relevante biologiske aktivitet4,5,6,7. Dog er hidtil dette potentiale ikke oversat til et utal af triterpen-afledte narkotika i klinikken. Dette er velsagtens (i det mindste delvis) en konsekvens af begrænset praktisk syntetiske adgang til denne klasse af sammensatte, et problem, der kan kvæle udforskning af struktur-aktivitet relationer og udvikling af føre kandidater af traditionelle lægemidler kemi arbejdsprocesser.
Forbigående udtryk af triterpen biosyntetiske enzymer fra andre plantearter i N. benthamiana blade kan aflede endogene forsyninger af 2,3-oxidosqualene mod produktion af nye værdifulde triterpene produkter (figur 1). Denne proces kan bruges til funktionelt karakterisere kandidat enzymer og rekonstruere de biosyntetiske veje af vigtige naturligt forekommende metabolitter. Ligeledes, det kan også udnyttes i kombinatorisk biosyntetiske tilgange til at producere roman triterpene produkter, en strategi, der kan resultere i biblioteker af strukturelt relaterede analoger, gør det muligt systematisk udforskning af struktur-aktivitet relationer biologisk aktive bly forbindelser8,9.
Agroinfiltration er en effektiv og enkel måde at opnå forbigående udtryk i N. benthamiana blade. Processen indebærer infiltration af blade med en suspension af A. tumefaciens transporterer binære udtryk construct(s) af interesse. Dette opnås via anvendelsen af pres, der tvinger væske gennem spalteåbninger, fortrænger luft i intercellulære rum, og erstatte det med A. tumefaciens suspension. Bakterierne overføre de respektive T-DNAs til indre af planteceller, medførende lokal og forbigående protein udtryk i infiltreret blad væv.
Mens nogen binære vektor egnet til generering af transgene planter kan være ansat for forbigående udtryk, vi udnytte den Cowpea mosaik Virus CPMV-afledte Hypertranslational (HT) protein udtryk system10, 11. i dette system gen af interesse er flankeret af utranslaterede regioner (UTR) fra CPMV RNA-2. 5′-UTR indeholder ændringer resulterer i meget høje niveauer af protein oversættelse med nogen afhængighed af virusreplikation12. Denne teknik er blevet udviklet i Easy-og hurtig (pEAQ) binære vektor serien, som indeholder lokationsspecifikke rekombination kloning protokol-kompatible konstruktioner (pEAQ –HT– DEST)10,11. De fleste pEAQ vektorer også indeholde en tomat busket stunt virus-afledte P19 silencing suppressor gen13 inden for T-DNA del af udtrykket kassette, der omgår behovet for at coinfiltrate en separat P19-regnskabsmæssige stamme og giver meget højt protein udtryk i værten plante celle10,11.
Brug af N. benthamiana som et udtryk vært har særlige fordele, når du arbejder med anlæg biosyntetiske veje. Celle-arkitekturen understøtter uløseligt passende mRNA og protein behandling og ordentlig opdelingen, ud over at have de nødvendige Co enzymer, reductases (for CYP450s) og metaboliske prækursorer. Carbon kilde er fotosyntese; planter kan således blot dyrkes i kompost af god kvalitet, der kræver kun vand, CO2 (fra luften) og sollys som input. Platformen er også meget bekvemt for Co udtryk for forskellige kombinationer af proteiner, som dette kan opnås facilely af co infiltration af forskellige stammer af A. tumefaciens, bevirke, at behovet at bygge store multigene udtryk kassetter. Derudover kan processen være lineært og pålideligt skaleret blot ved at øge antallet af planter, som anvendes i forsøget.
Tidligere arbejde i vores laboratorium har vist nytten af denne platform for forberedende skala eksperimenter. Dette omfattede udarbejdelse af roman Triterpener til brug i bioactivity assays og skala op for at opnå gram mængder af isolerede produkt. Desuden ophobning af heterogene triterpene produkter kan være steget flere fold af co udtryk af en N-terminal-afkortet, feedback-ufølsom form af 3-hydroxy, 3-methyglutary-coenzym en reduktase (tHMGR), en trafikhastighedsbegrænsning opstrøms enzym i mevalonsyre vej8.
Nøglen til sådanne præparativ-skala eksperimenter er evnen til at bekvemt op-skala infiltration proces. I en typisk eksperiment, kan snesevis til hundredvis af planter være nødvendigt at nå målet antallet af isolerede produkt. Infiltrerer enkelte blade i hånden (ved hjælp af et unødvendigt sprøjte) er driftsmæssigt krævende, og ofte uoverkommeligt tidskrævende, rendering denne metode upraktisk for rutinemæssig skala-up. Vakuum infiltration tilbyder fordele over hånd infiltration, som det er ikke afhængige af færdighedsniveau for operatøren og tillader infiltration af et større område af bladets overflade. Denne procedure bruges kommercielt til storproduktion af farmaceutiske proteiner14. Denne protokol udnytter en let replikerbar vakuum infiltration apparater, som kan være fremstillet af kommercielt tilgængelige dele. Dette giver mulighed for samtidige infiltration af op til 4 planter, giver hurtig og praktisk batch-wise infiltration af hundredvis af planter i en kort periode (figur 2a -2b). Vakuum infiltration apparatet består af et vakuum ovn, der danner infiltration kammer (figur 2f). Ovnen er forbundet til pumpen via en vakuum reservoir. Dette reducerer tidsforbruget til at opnå den ønskede vakuum i salen, infiltration. Planter er sikret i en skræddersyet indehaveren og omvendt i en 10 L rustfrit stål vandbad fyldt med A. tumefaciens suspension (figur 2a -2 c). Fuldstændig nedsænkning af de antenne dele af planterne er vigtige for effektiv infiltration. Vandbadet derefter placeres inden for infiltration kammer (figur 2d -2e), og det tomrum, som anvendes til at trække luften ud af blad interstitielle rum. Når trykket er blevet reduceret med 880 mbar (en proces, som tager ca. 1 min.) infiltration kammer bragte hurtigt tilbage til atmosfærisk tryk over 20-30 s ved at åbne indsugningsventilen ovn, hvorefter infiltration er fuldført.
Fem dage efter infiltration er af plantemateriale klar til høst og efterfølgende ekstraktion og isolation af de ønskede produkt(er). Fra dette punkt er processen blot en af naturprodukt ekstraktion og oprensning fra blad materiale, en arbejdsproces, der er velkendt for enhver naturprodukt kemiker. Der findes mange forskellige metoder til indledende ekstraktion og efterfølgende rensning15. Det mest hensigtsmæssige valg af metoder og de nøjagtige betingelser anvendes er stærkt afhængige af særlige kemiske egenskaber af sammensat af interesse, ud over tilgængeligheden af færdigheder og/eller udstyr. Det er ikke muligt at medtage i denne protokol et fuldt generaliserbart, trinvis metode til downstream behandling af høstede blad plantemateriale til enkeltstående produkt, der kunne følges blindt for enhver triterpene produkt af interesse, eller ville det være Det er hensigtsmæssigt for at forsøge at gøre dette. Men denne protokol vil give et overblik over den grundlæggende arbejdsgang bruges i vores laboratorium og nogle metoder for de tidlige faser af processen, som i vores erfaring har vist sig generaliserbart for mest iltet aglycone triterpene produkter. Dette omfatter to relativt ualmindeligt teknikker, nemlig trykbaerende opløsningsmiddel udvinding (PSE), og en praktisk heterogene fase metode for klorofyl fjernelse ved hjælp af en stærkt basisk ionbytter.
PSE er en yderst effektiv teknik til udvinding af små organiske molekyler fra faste matricer. Ekstraktioner udføres under pres (ca. 100-200 bar), den største fordel er evnen til at bruge afhjælpes temperaturer, som overstiger den kogende punkt af ekstraktionsmidlet. Dette kan reducere den tid og mængde opløsningsmiddel, der kræves for at opnå en udtømmende udvinding, sammenlignet med andre hot opløsningsmiddel teknikker som simple refluxerende eller Soxhlet ekstraktioner16. Kommercielle bænk-top PSE instrumenter er tilgængelige, som udnytter udskiftelige udvinding celler og automatiseret opløsningsmiddel håndtering, opvarmning og overvågning. Dette gør denne teknik yderst bekvemt. Det er også velsagtens mindre farlige, især for operatører med begrænset praktisk kemi erfaring.
Forsæbning af rå blad ekstrakter under refluks efterfulgt af væske-væske partitionering er en almindelig teknik til bulk fjernelse af klorofylfarvestoffer før efterfølgende rensning eller analyse. Men dette kan ofte være operationelt krævende på større skalaer. Endvidere kan påvisning af grænseflade eller produkt tab på grund af dannelsen af emulsioner være problematisk. Brug af stærkt basisk ionbyttende harpikser til at udføre heterogene fase hydrolyse kan tjene som et bekvemt alternativ. Den pigmenterede del af hydrolyseret klorofyl forbliver overholdt til harpiks og blot kan fjernes ved filtrering. Denne protokol udnytter en forberedende skala tilpasning af en tidligere rapporteret analytiske procedure17 , der beskæftiger en kommercielt tilgængelig grundlæggende ionbytteren.
Nedenfor beskriver vi en detaljeret og hurtige protokol for forberedende skala produktion af Triterpener udnytter denne plante-baserede platform. Denne protokol anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium til at forberede snesevis til hundredvis af isolerede triterpene produkt mg for programmer sådan en strukturel karakterisering af Kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, og/eller yderligere undersøgelse i funktionelle assays.
Høj gennem læg vakuum infiltration tillader denne protokol anvendes rutinemæssigt i vores laboratorium for den forberedende produktion af triterpen forbindelser af interesse for forskellige downstream applikationer. Vakuum infiltration apparatet beskrevet her er let replikeret. Tilsætning af vakuum reservoiret er tilrådeligt at reducere tidsforbruget til at trække den nødvendige vakuum, men det er muligt at blot genbruge en umodificeret vakuumtørreskabet infiltration afdeling. Beskytte vakuumpumpe via tilføjelsen af en egnet kondensator er teoretisk set fornuftigt, men i vores laboratorium, vi har fundet dette at være unødvendige.
Infiltration dækning er kompromitteret hvis bladene ikke er fuldt nedsænket i infiltration suspension. Dette problem er minimeret ved at sikre, at suspensionsniveauet når oversiden af indehaveren af anlægget, og at planten har en stram pasform for infiltration bad. Bemærk fra figur 2 , oversiden af indehaveren af anlægget er forsænket i til infiltration bad når på plads. Dette opnås ved paneler på midterste kanterne af indehaveren, som udgør ankerpunkt med toppen af infiltration bad. Infiltration suspension vil kræve regelmæssige Tilføjelser til at opretholde den suspension. Dette opnås bedst ved tilsætning af overskydende infiltration suspension at forhindre gradvis reduktion af OD600 i løbet af en stor batch-wise infiltration. Men i vores hænder, substitution for vand synes ikke at have en mærkbar effekt på forventede udbytter på en forberedende skala, selv om dette ikke har været kvantitativt undersøgt. Hvor mange planter kan være infiltreret fra én batch af infiltration suspension er stadig et åbent spørgsmål. Vi infiltrere rutinemæssigt mellem 100 og 200 planter med en enkelt batch af infiltration suspension. Derudover er det normalt for nogle jord at sive ned i infiltration suspension i løbet af infiltration proces. Dette er ikke blevet fundet for at have en mærkbar effekt på infiltration effektivitet.
Under høsten er det tilrådeligt (men ikke kritisk) til høst kun bladene, der blev infiltreret (nogle blade vil være vokset efter infiltration). Selektiv høst forhindrer fortynding med uproduktive væv, som ellers ville øge forholdet mellem endogene urenheder i forhold til sammensat af interesse. Dette har en nominel effekt på lethed af downstream rensning, og øger omfanget af disse processer. Når du bruger tHMGR til at øge forløber forsyning, er en necrosed fænotype ofte observeret for at udvikle perioden efter infiltration vækst. Dette er normalt og faktisk aids selektiv høst og downstream tørringsprocessen. Tørrede blade pulver kan normalt gemmes i en forseglet beholder i et køligt, tørt, mørkt sted, men ideelt i en ekssikkator under vakuum. Dette afhænger af stabiliteten i sammensat af interesserede. Vær forsigtig, hvis du vælger at gemme i et-80 ° C fryser. Sikre, at de tørrede blade er i en vandtæt beholder, og ved udlagringen, tillader denne beholder til varm til stuetemperatur før åbning. Udeblivelse vil resultere i rewetting af blade, hindrer down-stream processing.
Efter høst fremgangsmà ¥ den i denne protokol er til orientering, og for at støtte de forskere, der kan have begrænset praktisk kemi erfaring. De kan erstattes mange andre naturlige produkt udvinding/rensning teknikker. Som beskrevet i indledningen, PSE har mange fordele, men hovedstad koster af kommercielt tilgængelige PSE apparater kan være uoverkommelige, og det er ikke afgørende. Grundlæggende ionbyttende harpiks behandling er en meget praktisk metode til at erstatte traditionelle forsæbning efterfulgt af væske-væske partitionering. Det er imidlertid ikke egnet til produkter, der indeholder carboxylsyre grupper eller funktionelle grupper, der ville være hydrolyseret grundlæggende betingelser såsom estere. Disse produkter ville forventes at opbevares på grundlæggende ionbytteren. Men der er potentiale for at udnytte dette for en fange og løslade procedure (ikke dokumenteret her). Hvor traditionelle forsæbning ville være passende, fungerer grundlæggende ionbyttende harpiks behandling som et bekvemt alternativ. Kromatografi metode beskrevet i trin 9, er blevet fundet for at være generaliserbart for de forbindelser, der er beskrevet i figur 3. Forbindelser af øget polaritet kan dog kræve en udvidet 100% ethylacetat eluering periode. Med henvisning til trin 9.2, downstream fine rensning er helt sammensatte specifikke, og er også afhængig af omfanget. Gentagne runder af mindre målestok flash kromatografi med optimeret forløb, er normalt tilstrækkelig til at opnå en passende for NMR analyse renhed. På større skalaer er krystallisering ofte et bekvemt alternativ. I vanskelige tilfælde anvendes forberedende eller semi-forberedende high-performance væskekromatografi (HPLC) afhængigt af den ønskede mængde af isolerede sammensatte. Eksempler på downstream rensningsprocesser for en række repræsentative forbindelser kan findes andetsteds8.
Den nuværende protokol, som præsenteres her, bruges rutinemæssigt i vores laboratorium og har bevist nytte. Der er imidlertid stadig betydelige muligheder for yderligere optimering af udtryk-platformen. Arbejdet er løbende i vores laboratorium for at undersøge hvordan yderligere pathway engineering og differential kontrol af protein udtryk niveauer kunne forbedre triterpene produktionen yderligere, mens mægle toksicitet for værtsceller. Der er også potentiale til at undersøge manipulation af intracellulær transport systemer20,21, og retningen af enzymer til forskellige cellulære rum22,23, veje, som kan forbedre effektiviteten af flere oxidation begivenheder. Potentielle fordele ved at ændre den underliggende morfologi af centrale organeller kunne også undersøges. For eksempel er overekspression af domænet membran af Arabidopsis thaliana HMGR blevet observeret for at inducere hypertrofi af det endoplasmatiske reticulum i planter24; et centralt websted for CYP450 aktivitet. Denne protokol er særdeles velegnet til produktion af milligram gram-skala mængder af triterpen produkter, og kan være ansat i en forskning indstilling til at få adgang til forbindelser til downstream undersøgelse (fx systematisk udforskning af struktur-aktivitet relationer, og foreløbige undersøgelser i de farmakodynamiske og farmakokinetiske egenskaber af føre forbindelser af klinisk interesse). Men platformen er lineært og pålideligt skalerbare simpelthen ved at øge antallet af planter, der anvendes, og den praktiske gennemførlighed af forbigående udtryk via agroinfiltration er blevet påvist i industriel målestok til produktion af farmaceutiske proteiner 14, således er der potentiale for denne platform skal udvides til kommerciel produktion af høj værdi Triterpener. Alternativt er det også muligt at envision produktion af stabile transformants transporterer færdiggjort ønske multigene biosyntetiske pathway, giver mulighed for masse dyrkning og fortsatte ‘landbrug’ af transgene N. benthamiana stammer producere forskellige forbindelser af handelsmæssig værdi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en Norwich forskning Park Studentship (JR), yde fælles teknik og naturvidenskab forskning Rådet/bioteknologisk og Biological Sciences Research Council BBSRC-finansierede OpenPlant syntetisk biologi Research Centre (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); en John Innes centrum vidensudveksling og kommercialisering tilskud (BB/KEC1740/1) (BB); og BBSRC Institute strategiprogram Grant ‘Molekyler fra naturen’ (BB/P012523/1) og John Innes Foundation (A.O.). Vi vil gerne takke George Lomonossoff for at give pEAQ vektorer og Andrew Davis for fotografering.
GC-MS instrument | any | n/a | |
Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Standing incubator | any | n/a | |
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
Balance (2 figures) | any | n/a | |
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
A -80 freezer | any | n/a | |
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
Safety glasses | any | n/a | |
Lab coat | any | n/a | |
Autoclave | any | n/a | |
Consumables | |||
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
Reagents | |||
Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
Ethanol | VWR | 20821-330 | |
Milli-Q water | any | n/a | |
Levington F1 Compost | any | n/a | |
Levington F2 Compost | any | n/a | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |