Lung fiksering under konstant trykk for evaluering av emfysem i mus
Summary
Presentert her er en nyttig protokoll for lunge fiksering som skaper en stabil tilstand for histologiske evaluere lunge prøver fra en mus modell av emfysem. Den største fordelen med denne modellen er at den kan fikse mange lunger med samme konstante trykk uten lunge kollaps eller deflasjon.
Abstract
Emfysem er et viktig trekk ved kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS). Studier som involverer en emphysematous musemodell krever optimal lunge fiksering for å produsere pålitelige histologiske prøver av lungene. På grunn av innholdet i lunge strukturelle sammensetning, som hovedsakelig består av luft og vev, er det en risiko for at det kollapser eller deflates under fikseringsprosessen. Ulike lunge fiksering metoder finnes, som hver har sine egne fordeler og ulemper. Den lunge fiksering metoden som presenteres her utnytter konstant press for å muliggjøre optimal vevs evaluering for studier ved hjelp av en emphysematous mus lunge modell. Den største fordelen er at den kan fikse mange lunger med samme tilstand på en gang. Lunge prøver er innhentet fra kroniske sigarettrøyk-eksponert mus. Lung fiksering utføres ved hjelp av spesialisert utstyr som muliggjør produksjon av konstant trykk. Dette konstante trykket opprettholder lungene i en rimelig oppblåst tilstand. Dermed genererer denne metoden en histologiske prøve av lungene som er egnet til å evaluere sigarettrøyk-indusert mild emfysem.
Introduction
KOLS er en av de ledende verdensomspennende årsakene til dødsfall1. Sigarettrøyk er den viktigste årsaken til KOLS, men mekanismene for patogenesen forblir ufullstendig definert. KOLS demonstrerer to hoved egenskaper, inkludert progressiv begrensning av luftstrøm og en unormal betennelsesreaksjon i lungene. Emphysematous lidelse forekommer ofte i lungene til KOLS-pasienter2. Den patologiske funn av emfysem er preget av alveolære vegg ødeleggelse3. Flere dyrearter har blitt brukt til å generere KOLS-modeller i vivo (dvs. hunder, marsvin, aper og gnagere)4. Imidlertid har musen blitt den mest brukte i konstruksjonen av KOLS-modeller. Dette har mange fordeler, inkludert lave kostnader, evne til å være genetisk modifisert, omfattende genomisk informasjon tilgjengelighet, tilgjengelighet av antistoffer, og evne til å bruke en rekke mus stammer5. For øyeblikket er det ingen musemodell som kan etterligne alle funksjonene til humant KOLS; enkelte forskere må derfor velge hvilken modell som egner seg best for den spesifikke KOLS-forskningen6. Den emphysematous muse modellen er en av mange KOLS-musemodeller som er tilgjengelige for øyeblikket. Flere modeller inkluderer forverring musemodell, systemisk Co-morbidities modell, og KOLS mottakelighet modell7.
Den emphysematous muse modellen kan genereres av flere typer eksogene agenter, inkludert kjemiske stoffer og sigarettrøyk eksponering4. Kjemisk eksponering (f.eks. til elastase) gir en alvorlig type emfysem, mens sigarettrøyk resulterer i mild emfysem8,9. Sigarettrøyk antas å være den viktigste årsaken til patogenesen av KOLS; Derfor er valget av sigarettrøyk som et middel til å opprette en Kols musemodell rimelig10. Mange studier har brukt sigarettrøyk for å skape emfysem i musen. For eksempel, Nikula et al. hell skapt en emphysematous musen modell fra B6C3F1 kvinner mus av utsette seg å sigarett Smoke for 7 eller 13 måneder11. Vi har også etablert en emphysematous musemodell via senescence markør protein/SMP-30 KO mus12. Det er avgjørende å utføre en lunge fiksering metode som kan riktig visualisere denne milde emfysem modell av sigarettrøyk eksponering.
Det er opprettet ulike metoder for lunge fiksering13. Men det er ingen gull standard metode for lunge vev fiksering for å evaluere emfysem14. Flere studier fra denne laben har vist at fikserings systemet som presenteres her, er nyttig ved å skape en stabil tilstand for å evaluere emfysem12,15,16,17,18. Den største fordelen med dagens system er at det kan løse mange lunger med samme tilstand på en gang uten lunge kollaps eller deflasjon. Den nåværende lunge fiksering systemet bruker noe spesielt utstyr som gjør at lunge prøver å bli oppblåst ved et passende konstant trykk for en gitt periode. Dette spesialutstyret består av tre deler, inkludert en lavere container, øvre beholder og pumpe. Lunge prøver er plassert i den nedre beholder som er koblet til trykksatt festemidler, noe som resulterer i en 25 cmH2O trykkforskjell i nivået av agentene mellom de øvre og nedre beholdere19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fiksering prosedyre for gnager lungene som presenteres her er ikke romanen; imidlertid har dette systemet flere fordeler. For det første, den kanne fastsette mange lungen (maksimum av 20) med det likt forfatning i sin tid. The Society of toxicologic patologi fastslår at presset for tyngdekraften drypping varierer fra 22 – 25 cmH2O22. Spesielt har flere studier utført lunge fiksering ved et trykk på 25 cmH2O13,19…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet delvis av JSP KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) og Institutt for miljø-og Kjønnsspesifikk medisin, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Funder hadde ingen rolle i utformingen av dagens metoder og skriftlig manuskriptet.
Materials
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
- Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
- Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
- Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
- Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
- Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
- Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
- Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
- Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
- Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
- Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
- Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
- Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
- Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
- Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
- Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
- Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
- Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
- Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
- Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
- Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
- Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236 (2015).
- Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
- Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
- Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).
