낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

Summary

우리 여기는 생체 외에서 세대의 HBV DNA는 B 형 간염 바이러스 감염 시스템을 통해 설명 하 고 역을 사용 하 여 (1-2 부) 통합의 매우 민감한 탐지 중첩 PCR.

Abstract

B 형 간염 바이러스 (HBV)는 일반적인 혈액을 매개로 병원 체 간 암 및 간 경 변 증 만성 감염에서 결과 일으키는 원인이 되는. 바이러스는 일반적으로 episomal DNA 중간; 통해 복제 그러나, HBV DNA 파편의 호스트 게놈으로 통합 관찰 되었습니다, 비록이 양식을 바이러스 성 복제에 필요 하지 않습니다. 정확한 목적, 타이밍, 그리고 따라 장치를 마더보드에 HBV DNA에 의해 통합 발생은 아직, 하지만 최근 데이터 표시 그것은 아주 초기 감염 후 발생 하는 것. 여기, 생체 외에서 생성 및 통합 HBV DNA의 검출 자세히 설명 합니다. 우리의 프로토콜 특히 바이러스 세포 DNA 통합의 단일 복사본을 증폭 하며 절대 정량화 및 단일 자료 쌍 접합 시퀀스의 해상도 이 기술은 다양 한 HBV 돌연변이, 그리고 다양 한 약물 노출와 함께 다양 한 HBV 감염 세포 유형 (기본 인간의 hepatocytes 포함)에 적용 되었습니다. 우리는이 기술이 되는이 임상으로 관련 된 현상의 근본적인 분자 메커니즘을 결정 하는 주요 분석 결과 예견 한다.

Introduction

HBV는 이중 가닥 DNA 바이러스 평생 만성 감염을 일으킬 수 있는 간 경 변 증 및 간세포 암 (HCC)^1,2,3. 여러 분자 메커니즘 HBV 지 속성⁴ (epigenetic 바이러스 transcriptional 서식 파일의예를 들어, 높은 안정성), 면역 감시의 회피, 간에서 hepatocytes의 낮은 회전율 및 그것의 관련을 운전 하는 동안 위험 HCC 개시^5,6 (예, 만성 염증 및 세포의 활성화 경로 스트레스), HBV DNA 통합 호스트 세포 게놈 (모두 이러한 현상을 보고 메커니즘)으로 제대로 공부 하고있다 . 주요 이유는 적합 한 생체 외에서 감염 시스템의 HBV에 대 한 통합 이벤트의 믿을 수 있는 탐지를 허용 하는 부족 이다. 여기, 우리 생체 외에서 생성 한 기본 분자 메커니즘 및 그 결과 명료 하 게 하는 데 사용할 수 있는 HBV DNA 통합의 최근 개발 된 프로토콜을 설명 합니다.

HBV 복제 및 HBV DNA 통합의 형성은 이전 평가 되었습니다 세부 사항⁷. 간단히, HBV hepatocytes 감염^8,9에 대 한 주요 세포 수용 체로 나트륨 Taurocholate Co-transporting 펩 티 드 (NTCP)를 사용 하 여 입력 합니다. HBV 편안 원형 DNA (rcDNA)를 포함 하는 HBV nucleocapsids 게놈이 들어간다 핵는 rcDNA episomal covalently 닫힌된 원형 DNA (cccDNA)로 변환 됩니다. 핵 cccDNA 바이러스 성 mRNAs를 미리 게놈 RNA (pgRNA)¹⁰transcriptional 템플릿 역할을 합니다. HBV 중 합 효소 및 pgRNA 다음 새로 형성 된 nucleocapsids (HBV 핵심 단백질 이합체 구성)으로 패키징 됩니다. HBV pgRNA rcDNA 게놈 또는 더블-좌초 선형 DNA (dslDNA) 게놈^11,12nucleocapsid 내 역 문자입니다. 이러한 성숙 nucleocapsids HBV DNA 게놈을 포함 하는 마지막으로 덮여 고 virions로.

DslDNA 분자를 포함 하는 포함 된 입자에 의해 hepatocytes의 감염 호스트 세포 게놈¹³, HBV DNA^7,,1415복제 무능 형태의 선도에 바이러스 성 통합 될 수 있습니다. HBV DNA 통합 염색체 이중 가닥 DNA 틈¹⁵의 사이트에서 발생합니다. 증거를 축적 각 통합 이벤트 호스트 세포 게놈^16,17내 본질적으로 임의의 위치에서 발생 하는 것을 건의 한다. 또한, HBV DNA 통합 다소 발생 거의 10⁴ 셀^13,18,,1920당 1의 속도로. HBV DNA의 통합에 관한 중요 한 질문 특히 정확한 분자 통로, 바이러스에 대 한 의존도 호스트 요소, 통합된 형태, 그리고 그들의 가능한 기여에서 표현 하는 바이러스 성 항 원에 대 한 답이, 있다 바이러스 성 지 속성⁷ 우리는 이러한 일부의이 질문에 빛을 발산 하는 생체 외에서 모델을 설정 했습니다.

HBV 감염 생체 외에서 (통합 속도 셀 당와 각 고유한 통합의 복사본 수에 관하여 둘 다) HBV DNA 통합 이벤트의 희귀 한 모델 확인 검색에 도전 하는 그들. 세포 유사 분열으로 나누어 셀 효율적인 감염을 지원 하지 않는 우리의 생체 외에서 시스템에 제한 됩니다. 따라서, 달리 환자의 간 조직 hepatocytes의 상당한 클론 확장^18,19,를 발생 하는 위치에²⁰, 각 통합의 몇 가지 (1 ~ 2) 복사본은 셀의 지정된 풀에 매우 감염 체 외에 . 우리는 또한 통합 초기 감염 hepatocytes의 (그리고 아니라 지속적으로 만성 감염 hepatocytes에)¹³중에 주로 발생을 발견. 따라서, HBV DNA 통합 간단 하 게 더 긴 기간에 대 한 세포를 배양 하 여 증가 될 수 없습니다.

일반적으로, 이전 남부를 포함 하 여 통합된 HBV DNA를 검출 하는 데 사용 하는 방법 오 교 잡^{21,22,23,,2425}, Alu-PCR^{26,27 점} , 카세트 중재 결 찰 PCR²⁸, 그리고 전체 게놈 시퀀싱^{29,30,31,,3233}, 검출 감도 없어 통합의 단일 사본입니다. 우리와 다른 연구원은 사용 역 중첩 오리, 마 못, 그리고 인간의 감염된 간^{13,,1418,19, hepadnaviral DNA 통합 감지 하 PCR (invPCR) 34,,3536}. 다른 허위-긍정적인 신호 생성 변경 정량화³⁷에 대 한 능력을 제한할 수 있는 invPCR 기술 수정 절차를 도입 했습니다. 분석 결과이 프로토콜에서 설명 된 대로 수행, invPCR 특정 하 고 과민 한 분석 결과를 식별 하 고 수량화 (절대 복사 번호)에서 여러 HBV DNA 통합을 나타냅니다. HBV-세포 DNA 접합 바이러스의 bioinformatical 연구를 수 있도록 단일 자료 쌍 해상도 시퀀스와 통합¹³의 사이트에 호스트 DNA 시퀀스.

스냅-냉동 간 조직, 파라핀 끼워 넣어진 간 섹션, 매우 작은 조직 샘플에 의해 분리 등의 넓은 범위에서 추출한 DNA의 HBV에 감염 된 조직에 invPCR에서³⁸ 결과 앞서 설명한는 우리 레이저-서¹⁹. 이 프로토콜의 invPCR 분석 결과 생체 외에서 감염 후, 통합 (통합 당 1-2 부)의 낮은 복사 번호 생성 됩니다 셀 문화 파생 조직에서 추출한 DNA를 사용 하 여 업데이트 된 버전을 설명 합니다. 세포 게놈 및 접합은 통합된^13,16, 바이러스 시퀀스 내에서 그들의 배급에 관하여 환자의 조직에서 발견 그들을 닮는 HBV DNA 형성 통합에 체 외에서 제안 하는 감염 된 간 내에 유사한 통로

Protocol

1. 세포 감염 및 DNA 추출 교양된 Huh7-NTCP 셀8,9 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)에 하 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 그리고 2 m L-글루타민 m x 1와 보완을 유지 합니다.참고: 이것은 이전 알려졌다 세부40에. 시드 2 x 105 셀/mL Huh7 NTCP 셀 DMEM 1 mL와 함께 12-잘 접시로. 세포 치료 (예를 들어, HBV 억제제)를 테스트 하는 경우 적용할 표면에 뜨는 문화에 4 h 시드 (1 일 HBV 감염이 이전) 후. 음수는 컨트롤에 대 한 적용 200 nM Myrcludex B (는 강력한 HBV 항목 억제제41). 1000 VGE/셀 문화 미디어 (DMEM 보충 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 2 m L-글루타민, m 및 2.5 %v / v x 1의 500 µ L에서 세포를 감염 하는 inoculum HepAD3843 에서 헤 파 린-열 순화42 상쾌한 사용 DMSO) [인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1에 녹아] 4 %w / v 폴 리 에틸렌 글리콜 8000에 포함 된. (5% CO2 와 90% 습도 설정) 37 ° C 배양 기에서 세포 문화. 16-24 h 감염 된 후에 살 균 1 x PBS의 1 mL로 두 번 셀을 씻어. 문화 미디어 수확까지 HBV 감염을 따르는 2 일 마다 교체 합니다. 감염 된 후 3 일에서 5 µ M 테 노와 10 µ M 세포 치료 Lamivudine invPCR에 의해 amplifiable는 HBV 일차 중간체의 생산 제한. 감염 된 5 일 후, 트립 신-EDTA의 200 µ L 셀 trypsinize과 DMEM (보충 10 %v / v 태아 둔감 한 혈 청, 페니실린/스, 그리고 2 m L-글루타민 m x 1), 또한 포함 하는 5 µ M 테 노와 10 µ M의 2 ml resuspend Lamivudine입니다. (어떤 보고 되었습니다 HBV cccDNA44 와 amplifiable는 다른 HBV DNA 중간체의 손실을 유도 하 여 invPCR) 유사 분열의 한 라운드를 유도 하기 위해 6 잘 플레이트 세포 정지를 전송 합니다. 7 일 감염 된 후, 트립 신-EDTA의 400 µ L에 확장된 셀 trypsinize 고 DMEM 1 mL에 혼합물을 resuspend. 1.5 mL 튜브에 정지를 배치 하 고 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 포부에 의해는 상쾌한을 제거 합니다. (선택 사항) 그들은 DNA 추출에 대 한 준비가 될 때까지-20 ° C에서 셀 펠 릿을 저장 합니다. 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출 키트를 사용 하 여 셀 펠 릿에서 DNA를 추출 합니다. 광학 densitometry를 사용 하 여 최종 DNA 농도 견적 한다.참고: 100 μ 차입 볼륨에서 DNA 수율은 일반적으로 250 ~ 400 ng/μ. 2입니다. DNA의 반전 총 DNA의 aliquot ~1.5–2.5 μ g 200 μ PCR 튜브에 1 단계에서 추출 합니다. 금지 효소 소화 반응 버퍼 x 1을 포함 하는 40 μ 반응 볼륨을 마스터-믹스의 적절 한 금액을 추가 (예., CutSmart 버퍼)와 10 U Nco난-HF. 반응을 철저 하 게 혼합 하 고 작은 튜브 원심 분리기에 아래로 회전. 제한 효소 반응이 최적의 소화 효율에 대 한 1 시간에 대 한 37 ° C에서 PCR 기계에 품 어. 20 분 동안 80 ° C에서 배양 하 여 제한 효소 비활성화. 1.5 mL 튜브에 대 한 전체 제한 효소 반응 전송. T4 DNA 리가 버퍼와 500 U의 T4 DNA 리가 x 1의 400 μ를 추가 하 고 그것을 철저 하 게 혼합. 큰 반응 볼륨 소화 DNA 파편의 내부 분자 (분자 간) 반대 결 찰을 권장합니다. 결 찰 반응 완전 결 찰 되도록 2 시간 실 온에서 품 어. 20 분 동안 70 ° C에서 T4 DNA 리가 비활성화 T4 리가의 완전 한 비활성화 되도록 10 %w / v 나트륨 라우릴 황산 염의 10 μ를 추가 합니다. 펄스 vortexing에 의해 튜브를 혼합 하 고 짧게 반응 혼합 아래로 회전. 90 µ g/mL의 최종 농도를 100 m m와 dextran (35-45 kDa)의 최종 농도에 NaCl을 추가 합니다. 펄스 vortexing에 의해 튜브를 혼합 하 고 짧게 반응 혼합 아래로 회전. 반전에 의해 100% 에탄올과 혼합의 900 μ를 추가 합니다. 하룻밤-20 ° C에서 DNA를 침전. 펠 렛 15 분 14000 x g에서 원심 분리 하 여 침전 된 DNA P200 피 펫과 포부는 상쾌한을 제거 합니다. 14000 x g 15 분 동안에 70 %v / v 에탄올과 원심 분리의 500 μ와 펠 릿을 세척. P200 피 펫과 포부에 의해 에탄올을 제거 합니다. 20 분 동안 실 온에서 DNA 펠 릿 건조 분해 소화 반응 버퍼 x 1, 5 U BsiHKAI의 그리고 5 U Sph-HF. 품 40 μ 반응 볼륨을 제한 효소 마스터 믹스의 H2o. 추가 20 μ의 20 μ에 펠 릿에서 제한 효소 반응 한 열-블록 37 ° C ( SphHF에 대 한 최적의 온도) 1 시간에서. 짧게 반응 혼합 아래로 회전 합니다. 65 ° C ( BsiHKAI에 대 한 최적의 온도) 1 h에서 열 블록에 제한 효소 반응을 품 어. 짧게 반응 혼합 아래로 회전 합니다. 다음 단계까지-20 ° C에서 거꾸로 DNA를 저장 합니다. 3. 중첩 된 PCR DNA 저하 솔루션을 사용 하 여 재사용 가능한 실리콘 매트 봉인에서 잠재적인 amplicons를 제거 하 고 매트 DNA 무료 물으로 깨끗이 씻어 PCR 혼합물을 준비 하는 동안 실 온에서 건조. 외부 앞으로 포함 하는 1 x PCR 믹스의 1 mL를 준비 (5′-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3′)와 역 (5′-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3′) 0.5 µ M의 농도에서 뇌관. 웰 스 a 1과 E1 PCR 96 잘 접시에 170 μ 1 x PCR 믹스를 추가 합니다. 웰 스 B1 H1 120 μ 1 x PCR 믹스를 추가 합니다. 단계 2에서에서 a 1과 E1 웰 스 거꾸로 dna 10 μ를 추가 (2 다른 거꾸로 샘플 같은 PCR 접시에 분석 될 수 있다). 믹스에 각각 약 10 배를 부드럽게 pipetting으로 각 잘 반응 사용 P1000 100 μ로 설정 하 여. 순차적으로 희석 샘플에서 각 단계에서 60 μ를 전송 하 여 1: 3의 비율로 a 1 D1 우물. 부드럽게 10 번 사용 하 여 100 μ로 설정 P1000 pipetting으로 각 단계에서 우물을 믹스. 거품을 형성 하지 마십시오. 잘 H1 아래로 diluting 잘 E1 단계 3.6를 반복 합니다. 사용 하 여 다중 채널 피 펫 웰 스 A2-H2, H3 a 3에 우물 A1-H1 등 96 잘 접시의 우물 A12 H12 도달까지 반응 혼합물의 aliquot 10 μ. 단계의 3.1, 단단히 눌러 건조 실리콘 매트 PCR 플레이트 커버. PCR 기계에 접시를 놓고 다음 프로그램 실행: 95 ° C에서 10 분 15의 35 주기 95 ° C, 15에서 s s 54 ° C 및 72 ° C에서 3 분에서 72 ° C에서 7 분 그런 다음 실 온에서 접시를 개최. 분 젠 버너와 고온에 96 핀 복제기의 핀 열 하 고 실 온에서 적어도 5 분 동안 쿨. 10 μ 1 x PCR 혼합 (젤 로드 준비 버퍼 포함)와 내 면 앞으로의 두 번째 PCR 접시의 우물을 채워 (5′-CGC ATG 개 그 ACC ACC GTG A-3′)와 역 (5′-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3′)에서 0.5 µ M. 조심 스럽게 라운드 PCR 96 잘 접시의 PCR 접시에서 실리콘 매트를 제거 하 고 우물 사이의 교차 오염을 방지. 냉각된 복제기를 사용 하 여 새로 aliquoted 96 잘 접시에 1 라운드 PCR에서 96 잘 접시의 PCR 제품을 전송. 초기 변성 단계 95 ° C에서 10 분에서 2 분으로 변경 제외한 3.8, 단계 에서처럼 동일한 조건을 사용 하 여 중첩 된 PCR을 실시 합니다. 4. PCR 제품 고립과 젤 추출 1.3 %w / v agarose 젤 96-잘 사용 하는 젤 전기 이동 법으로 PCR 제품을 분석. 100 mL agarose 젤에 대 한 10-15 분에 대 한 200 V에서 실행 합니다. 일회용 마시는 빨 대를 사용 하 여 agarose 젤에서 DNA 밴드 삭제하시오 각 PCR 제품에 대 한 빨 대 놓고 agarose 젤 1.5 mL 튜브에 연결 하 고가 위로 빨 대 크기를 손질 합니다.참고: 단일 PCR 제품 해결 될 수 있는 그 희석 에서만에서 밴드 분리 충분 하다. (선택 사항) -20 ° C 이상 추출에서 튜브를 저장 합니다. 밀 짚 조각의 끝에 당기고 하 여 각 관으로 agarose 플러그를 꺼냅니다. 각 튜브를 젤 추출 버퍼의 300 μ와 젤 추출 유리 구슬 슬러리의 5 μ를 추가 합니다. (를 제외 하 고 세척 단계에 대 한 반-볼륨을 사용 하 여) 젤 추출 키트에 대 한 제조업체의 지침에 따라 PCR 제품을 추출 하 고 물 30 μ와 구슬에서 DNA elute. 생어 순화 된 DNA 제출 두 번째 라운드에서 사용 하는 앞으로 뇌관 (공급 업체의 지침)에 따라 시퀀싱 중첩 PCR. 5. 시퀀스 분석 뉴클레오티드 폭발 분석 (를 사용 하 여 전체 뉴클레오티드 컬렉션을 정렬 하는 기본 설정)를 수행 하 여 바이러스 세포 DNA 연결을 확인 합니다.참고: 대표적인 결과 그림 3 아래에 자세히 나와 있습니다. 시퀀스의 부분 정렬, 관찰 하는 경우에 잘라 5′ HBV DNA 시퀀스 다시 폭발 분석을 실행 하기 전에. 지정 된 시퀀스 나타냅니다 다음과 같이 진정한 통합 접점 확인 하 엄격한 선택 기준 적용: 포함 된 시퀀스가 포함 > 20 세포 게놈을 확신 매핑 위한 셀룰러 시퀀스의 혈압. 10 가정된 바이러스-세포 통합 교차점, 그들은 가능성이 대표 체 외에서 결 찰 이벤트의 혈압 보다 진정한 통합 연결 내에서 사용 하는 모든 효소의 금지 사이트를 포함 하는 모든 시퀀스를 무시 했다. 이들은 연속 반응 동안 교차 오염에 의해 생성 된 가능성이 유물으로 시퀀싱 chromatographs에 가정된 통합 접합의 양쪽에 명백한 비슷하지 피크 형광 수준으로 어떤 시퀀스를 무시 하거나 모 세관 착 색 인쇄기입니다. 그 정확한 HBV와 바이러스 세포에 세포 시퀀스 고유한 통합 이벤트를 정의 합니다.참고: 고유한 통합 이벤트의 반복 (부정적인 제어 반응, 대표적인 결과에 설명 추가 사용 하 여 시험 될 수 있는 PCR 동안 그 통합 또는 교차 오염을 포함 된 셀의 클론 확장에서 발생할 수 있습니다. 아래 참조). 특정 세포 시퀀스에 반복된 통합 비 동종 최종 가입 경로 사용된15각 통합 이벤트에 대 한 다른 HBV 터미널 사이트를 표시 하려면 예상 된다. 통합 주파수 정규화 총 DNA 입력 양을 반전 반응으로 다음 그 희석에서 바이러스-셀 연결의 수에 의해 거꾸로 DNA 템플렛의 희석 비율을 곱하여 계산 합니다. 일반적으로, 통합 주파수 1시 10분의 순서는4 셀.

Representative Results

InvPCR 기술은의 도식 대표는 그림 1에 표시 됩니다. PCR 제품 절연 전후는 예제 agarose 젤 전기 이동 법 성공적인 invPCR의 그림 2 에 표시 됩니다. 그림 3 의 HBV DNA 일차 중간 단계 (i) 바이러스 세포 DNA 접점의 확대 및 (ii) 증폭의 경우에서 5.1에서에서 폭발 분석 출력을 보여 줍니다. 긍정적인 결과 예상: Huh7 NTCP 셀이 HBV 주식 덤플링을 정화 (그림 1) 위에서 설명한 대로 감염 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 이 경우, 단일 PCR 제품 각 샘플 (희석, 그림 2당 10 ~4 셀 등가물에 해당)의 두 번째 또는 세 번째 1:3 희석에 의해 달성 되어야. 이 희석에서 제품의 약 50% 나머지 절반 HBV DNA 중간체 (그림 3)의 증폭을 나타내는 진정한 바이러스-세포 DNA 접합, 대표할 것 이다. 이전 연구13, 우리 반복된 바이러스-세포 접합, 제안 우대 HBV DNA 통합의 아무 세포 게놈 사이트의 몇 가지 사례를 발견 했다. 우리는 또한 그 바이러스 세포 접합의 >80% 사이 발생 뉴클레오티드 1732 및 1832 (뉴클레오티드의 번호 찍기 HBV 유전자 형 D, 은행 가입 #U95551.1)에 따르면 후자 나타냅니다 HBV dslDNA 폼의 오른쪽 종점을 찾을. 진정한 바이러스-세포 접합부 실험 체 외에 있는 우리의 방법을 통해의 시퀀스 은행 (승인 번호 MH057851 MH058006)에 공개적으로 사용할 수 있습니다. 부정적인 결과 예상: Huh7 NTCP 세포를 감염 되지 않은 또는 주사 Huh7 NTCP Myrcludex B로 미리 치료 하는 세포 부정적인 컨트롤 역할을 할 수. 이 세포에서 추출한 DNA의 InvPCR 분석 PCR 제품을 생산 한다. 긍정적인 샘플으로 같은 PCR에 이러한 부정적인 제어 샘플 실행 중첩 PCR 과정의 교차 오염 테스트 수 있습니다. 교차 오염에 대 한 가장 엄격한 테스트 스 A-D 부정적인 제어 샘플 및 96 잘 접시에 스 E-H 긍정적인 샘플의 실행 이다. 이 경우에, 긍정적인 샘플의 가장 집중된 희석 부정적인 샘플의 적어도 집중된 희석에 직접 인접 한 행에서 실행 됩니다. 증폭 제품 부정적인 제어 샘플에서 관찰 된다, 하는 경우 교차 오염을 이벤트를 최소화 하기 위해 토론에 제안 대책 연구소. 그림 1: HBV DNA 통합 검색 invPCR 프로세스의 도식 그림. HBV 감염, Huh7-NTCP 세포의 단지 소수 민족 포함 HBV dslDNA (레드) 호스트 세포 게놈 (레드) 통합, 후 위쪽 섹션에 그려져 있습니다. 총 DNA는 세포 (1 단계)에서 추출, (2 단계) 반전, 그리고 중첩된 PCR (3 단계)에 의해 증폭. 제한 효소 사이트의 상대 위치는 표시 (Nco어 BsiHKAI) 삭제 바이러스-세포 DNA 접합에서. 그림은 이전 게시13에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: Agarose 젤 전기 이동 법 및 성공적인 invPCR의 후속 젤 추출. “M” DNA 마커 사다리를 나타냅니다. 12의 각 행은 PCR에 단일 희석에 기술 복제를 나타냅니다. PCR 플레이트/agarose 젤 당 두 거꾸로 DNA 샘플을 실행할 수 있습니다. 각 희석에 대 한 PCR 제품 ~ 1에 밖으로 적정 한다: 3 비율. 단일 밴드 쉽게 격리 될 수 있는 두 가지 이상 집중된 희석에서 제품의 추출은 일반적으로 충분 하 고, HBV DNA 통합 속도 끝점 적정에 의해 결정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: invPCR 제품 시퀀스의 폭발 분석. 시퀀스의 긴 책자는 생어 시퀀싱의 소스에서에서 생성 된 DNA 순서 일반적으로 모호 하지 않습니다. HBV와 세포 게놈을 강한 정렬 생어에서 생성 된 FASTA 시퀀스 파일의 서로 다른 영역에서 관찰 진정한 바이러스-세포 DNA 접합 제안 상단 패널에 시퀀싱. 하단 패널에 순서 재배열된 HBV DNA 게놈 증폭에 의해 생성 된 제품을 제안 하는 HBV 게놈의 조각에만 정렬 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

프로토콜을 수행 하기 전에이 invPCR 분석 결과 매우 중요 한 기술, DNA 서식 파일의 단일 복사본을 증폭 할 수는 중요 하다. 따라서, PCR 제품에서 오염을 제한 최대 중요성 이다. PCR 제품 오염 제한 하는 일반적인 전략은 다음과 같다. (i)는 방법의 다른 단계에 대 한 물리적으로 별도 영역을 설정 합니다. 각 지역에서 별도 실험실 코트, 하 고 장갑이이 영역 사이 이동할 때 변경 해야 합니다. 오염 될 가능성이 적어도 대부분의 순서로 아래이 지역 나열 했습니다 우리: PCR 제품 추출 및 시퀀싱 반응 설정 영역 (게시물-PCR); PCR 서식 파일 추가 및 타오르는 핀 전송 영역 (우리는 사용한 PCR 후드 좋은 결과 함께 오염을 UV 램프); DNA 추출 및 반전 영역 (pre-PCR); 그리고 “템플릿 무료 DNA” 지역 준비 재고 및 PCR 솔루션만 사용. (ii) 수 교차 오염을의 잠재적인 드라이버로 실험실에서 공기 흐름의 인식. 특히, 발생 하는 것입니다 염증이 핀 전송 단계 PCR 반응의 교차 오염을 가장 높습니다 통합 주파수의 부정확 한 정량화를 리드. 이러한 크로스-전류 제한 하 PCR 후드를 사용할 수 있습니다. PCR에 부정적인 제어 우물 (예를 들어, Myrcludex B 처리 샘플 또는 템플릿 컨트롤 없음) 또한 교차 오염에 대 한 테스트를 사용할 수 있습니다. (iii) 펫에 잠재적인 PCR 오염 물질을 제한 하 고 정기적으로 DNA 저하 솔루션으로 그들을 닦 여 표면 작업.

여기에 지정 된 프로토콜은 HepAD38 셀 선⁴²에서 생성 된 알려진된 감염 HBV 복제의 통합 감지 하 배열 된다. 사용 inoculum 다른 HBV DNA 시퀀스 (예: 환자 혈 청에서)의 경우, 다음 HBV 게놈 해야 될 처음 시퀀싱 PCR 뇌관 및 반전 디자인의 호환성을 확인 하. 이전에 게시 연구¹⁹, 우리 HBV DNA 통합 접합의 예상된 사이트 측면 보존된 HBV DNA 시퀀스를 결속 하는 프라이 머의 3 세트를 이용 했다. 다른 뇌관 시퀀스 및 프로토콜 결정 HBV^{44,45,,4647,48} 의 게놈 시퀀스를 설명 하 고 성공적으로 작동 수 있습니다.

또한, 다른 HBV 감염 셀 (예를 들어, 기본 인간의 hepatocytes, 차별화 된 HepaRG, HepG2-NTCP)을 사용할 수 있습니다; 그러나, 우리는 Huh7 NTCP 세포 DNA 접합은 증폭 하는 증폭된¹³이 바이러스 중간 DNA에 비해 바이러스 세포의 수를 고려할 때 최고의 신호 대 잡음 비율, 제공을 발견 했다. 특히, 기본 인간의 hepatocytes 등 차별화 된 HepaRG 말기 분화 세포 유사 분열, 세포 내에 남아 있는 amplifiable HBV DNA 일차 중간체의 높은 수준의 결과 효율적으로 받을 하지 할. 우리는 증폭된 시퀀스의 ~ 90% 나타내고 HBV DNA 재배열 (통합 이벤트 하지) 말기 차별화 된 셀에서 은 셀 라인¹³에서 70-50%에 비해 발견 했다. 이들 제품은 일반적으로 HBV DNA 게놈을 포함 하는 표면 및 핵심 오픈 프레임, 읽기에 큰 삭제 또는 이전 Sph사이트에 사이트를 추가 Nco와 HBV 유사 종 나타낼 수 있습니다. HBV 종을 (를 포함 하 여 도식 다이어그램) 증폭 설명에 자세히 이전¹³.

이 방법에는 몇 가지 단점이 있다. 힘들고 여러 날의 특성상이 프로토콜, invPCR 샘플의 많은 수의 높은 처리량 분석에 적합 하지 않습니다. 또한, 그것 제한 희석 적정 의존, 우리의 방법은 정확 하지 않습니다 매우 정량화;에 비록, 그것은 쉽게 통합 주파수에 로그 수준 변화를 측정 한다.

또한, 우리의 반전 프로토콜은만 HBV 통합의 대부분이 지역⁴⁹내 발생으로 HBV 게놈의 DR2 DR1 지역 간에 발생 하는 통합 검색에 적합 하 고. HBV 환자의 조직의 NGS 분석을 큰 소수를 보이고 있다 (최대 ~ 50%)도이 지역⁴⁹외부 발생할 수 있습니다. 새로운 invPCR 디자인은 이론적으로 이러한 다른 통합 사이트를 검색할 수 있지만 그들이 하지 (우리의 지식)에 왔다 아직 실시. Relatedly, 반전 반응에 대 한 바이러스 세포 접합 시퀀스에서 하류 필요한 필요한 제한 효소 사이트 인 invPCR를 검색 하지 않습니다 HBV 게놈의 DR2 DR1 지역 내에서 발생 하는 모든 통합 (즉, 우리 가 추정 되었다 모든 통합의 ~ 10%는 철에 시뮬레이션¹³를 사용 하 여 감지). 그러나, 다른 치료의 작은 숫자와 샘플의 집중된 배치에 적용 하면, invPCR 단일 기지-쌍 해상도에서 통합된 HBV DNA를 탐지 하기 위한 유일한 실용적인 방법 중 하나입니다.

우리는 따라서 휴대 (녹아웃 또는 특정 세포 유전자의 overexpression 또는 다양 한 약물의 응용 프로그램을 통해), 및 환경 ( (HBV inoculum의 돌연변이)를 통해 바이러스를 찾는 데 중요 한 역할을 제공 하는이 방법의 응용 프로그램을 구상 예를 들어, 산화 스트레스에 노출) HBV DNA의 통합을 유도 하는 요인. 이 메서드 및 새로 개발된 된 HBV 감염 시스템, 우리가 이러한 요인의 전례 없는 제어를 사용 하는 그들은 잘 격리 하 고 더 나은 특징이 될 수 있도록. 우리는 또한이 HBV DNA 통합을 포함 하 여 어떤 정도 바이러스 성 항 원 (예를 들어, HBx 또는 HBsAg⁵⁰)이이 식을 컨트롤 통합된 양식에서 표현 된다 세포 결과의 핵심 이해로 이어질 것입니다 기대 그리고 여부 HBV 통합 훨씬 더 프로 종양 스테이트 세포 표현 형을 변경. 이러한 미래 연구의 결과 만성 B 형 간염을 치료 하는 데 사용 하는 치료 전략에 및 바이러스 자체에 대 한 기본적인 이해에 지대한 영향을 해야 합니다.

Materials

Dulbecco’s PBS	PAA	H15-002
DMEM medium	Thermo Fisher Scientific	41965
Fetal bovine serum	PAA	A15-151	Heat-inactivate before use
Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100×	PAA	P11-010
L-glutamine, 200mM	PAA	M11-004
Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1×	PAA	L11-004
PEG, MW 8000	Sigma-Aldrich	89510	Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use
DMSO for spectroscopy	Merck	102950
Tenofovir disoproxil	Sigma-Aldrich	CDS021622	Dissolve in DMSO
Lamivudine	Sigma-Aldrich	L1295	Dissolve in DMSO
NucleoSpin Tissue kit	Macherey Nagel	740952.250
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NcoI-HF	NEB	R3193L
T4 DNA ligase	NEB	M0202T
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	433209
Dextran (35 -45 kDa)	Sigma-Aldrich	D1662-10G
Absolute Ethanol	Sigma-Aldrich	32205-1L-D
BsiHKAI	NEB	R0570L
SphI-HF	NEB	R3182L
Amplitaq Gold Taq kit	Thermo Fisher Scientific	4331816	Use for first nest PCR
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates	Biorad	2239442
DNAZap PCR DNA Degradation Solution	Thermo Fisher Scientific	AM9890
96-well PCR plates	Sigma Aldrich	CLS6509 SIGMA
96-pin replicator	Thermo Fisher Scientific	250520
GoTaq Flexi PCR kit	Promega	M8295	Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel
Biozym LE Agarose	Biozym	840004
QIAEX II Gel extraction kit	QIAGEN	20051