Vi beskriver här den in vitro- generationen av HBV-DNA via ett system med hepatit B virus infektion och känslig detektion av dess (1 – 2 kopior) integration med inversen nästlade PCR.
HepatitB Virus (HBV) är en gemensam blodburna patogener som orsakar levercancer och levercirros som följd av kronisk infektion. Virusen replikerar generellt genom en episomal DNA mellanliggande; men har integration av HBV-DNA-fragment i värd genomet observerats, trots att denna form inte är nödvändigt för virusreplikation. Den exakta ändamålet, timing och mekanismerna genom vilka HBV-DNA-integreringen sker är ännu inte klart, men senaste data visar att det sker mycket tidigt efter infektion. Här, beskrivs in vitro- generering och påvisande av HBV-DNA integrationer i detalj. Våra protokoll specifikt förstärker lösnummer av virus-cell DNA integrationer och tillåter både absolut kvantifiering och singel-baspar resolution av sekvensen junction. Denna teknik har tillämpats på olika typer av HBV-mottagliga celler (inklusive primära humana hepatocyter), olika HBV mutanter, och i samband med olika drog exponeringar. Vi förutser denna teknik blir en viktig analys att bestämma de underliggande molekylära mekanismerna av detta kliniskt relevanta fenomen.
HBV är en dubbelsträngat DNA-virus som kan orsaka livslångt kronisk infektion, vilket leder till levercirros och Hepatocellulär cancer (HCC)1,2,3. Medan det finns flera molekylära mekanismer körning HBV persistens4 (t.ex. hög stabilitet av epigenetiska viral transkriptionell mallen), undvikande av immun övervakning och låg omsättning på hepatocyter i levern och dess associerade risken av HCC inledande5,6 (t.ex. kronisk inflammation och aktivering av cellulär stress vägar), HBV-DNA integrering i den mottagande cell arvsmassan (en rapporterade mekanism för båda dessa fenomen) dåligt har undersökts . En viktig orsak är bristen på lämpliga in vitro- infektion system för HBV som tillåter tillförlitlig upptäckt av integration händelser. Här beskriver vi ett nyligen utvecklade protokoll för både in vitro- generationen och påvisande av HBV-DNA-integrationer som kan användas för att klarlägga de molekylära mekanismer bakom och konsekvenser därav.
HBV-replikation och bildandet av HBV-DNA integration har tidigare granskats i detalj7. Kort, HBV träder hepatocyter med natrium cotransporting Co-transporting peptid (NTCP) som den främsta cellulära receptorn för infektion8,9. De HBV nucleocapsids innehållande HBV-avslappnad cirkulär DNA (rcDNA) in genomet i kärnan, där rcDNA omvandlas till episomal kovalent stängda cirkulär DNA (cccDNA). Den nukleära cccDNA fungerar som transkriptionell mallen för virala mRNA och pre genomisk RNA (pgRNA)10. HBV-polymeras och pgRNA sedan paketeras till nybildade nucleocapsids (bestående av HBV core protein dimerer). HBV-pgRNA är omvänd-transkriberas inom den nucleocapsid, vilket resulterar i antingen en rcDNA arvsmassa eller en dubbelsträngat linjära DNA (dslDNA) genomet11,12. Dessa mogna nucleocapsids innehållande HBV-DNA-genomet är slutligen höljeförsedda och exporteras som virioner.
Infektion i hepatocyter av höljeförsedda partiklar som innehåller dslDNA molekyler kan resultera i viral integrering i den mottagande cell genomet13, leder till replikering-inkompetent former av HBV-DNA7,14,15. HBV-DNA-integreringen sker på platsen för kromosomala dubbelsträngat DNA raster15. Ackumulerande bevis tyder på att varje integration händelse inträffar i en i huvudsak slumpmässig position inom den mottagande cell genomet16,17. Dessutom, HBV-DNA-integreringen sker något sällan, till en växelkurs på 1 per 104 celler13,18,19,20. Viktiga frågor om HBV-DNA integration förblir obesvarade, särskilt när det gäller de exakta molekylära vägar inblandade, beroendet av viral och värd faktorer, de virala antigener som uttrycks från integrerade former och deras möjliga bidrag till viral persistens7. Vi har satt upp en in vitro- modell för att belysa några av dessa frågor.
Sällsynthet av HBV-DNA integration händelser (både när det gäller integration ränta per cell och kopia antalet varje unik integration) i in vitro- HBV-infektion modeller gör dem svåra för att upptäcka. Cell Mitos är begränsad i vårt in vitro- system, som delande celler inte stöder effektiv infektion. Således, till skillnad från i patientens levern vävnader där betydande klonal expansion av hepatocyter uppstår18,19,20, mycket få (1 till 2) exemplar av varje integration finns i en viss pool av celler infekterade in vitro- . Vi har också funnit att integration uppstår främst under den första infektion av hepatocyter (och inte kontinuerligt i kroniskt infekterad hepatocyter)13. HBV-DNA integration inte kan följaktligen ökas enkelt odla celler för en längre period.
I allmänhet blot tidigare metoderna att upptäcka integrerat HBV-DNA, inklusive södra hybridisering21,22,23,24,25, Alu-PCR26,27 , kassett-medierad ligering PCR28och hela genomet sekvensering29,30,31,32,33, inte har känslan av att upptäcka singel-kopior av integrationer. Vi och andra forskare har använt inversen nästlade PCR (invPCR) för att upptäcka hepadnaviral DNA integration i anka, murmeldjur och mänskliga infekterade lever13,14,18,19, 34,35,36. Andra har infört processuella ändringar till invPCR tekniken som kan förändra generationen av falskt positiva signaler och begränsa möjligheten för kvantifiering37. Om analysen utförs som beskrivs i detta protokoll, representerar invPCR en specifik och känslig analys som identifierar och kvantifierar (i absolut kopia numrerar) flera HBV DNA integrationer. HBV-cell DNA korsningen sekvenseras med singel-baspar upplösning, så att bioinformatiska studier av viral och värd DNA sekvenser på platserna för integration13.
Vi har tidigare beskrivit38 resultat från invPCR på DNA av HBV-infekterade vävnaden utvinns ur ett stort utbud av källor, inklusive snapin-fryst levern vävnader, paraffin-inbäddat lever sektioner och extremt små vävnadsprover som isolerats av Laser-lokalt19. Detta protokoll beskriver en uppdaterad version av ett invPCR test med hjälp av DNA extraheras från cell kultur-derived vävnader efter in vitro- infektion, där låg kopia antal integrationer (1 – 2 kopior per integration) genereras. HBV-DNA integrationer som bildas av in vitro- likna dem som finns i patientens vävnader med avseende på deras fördelning över det cellulära genomet och junction inom viral sekvensen som är integrerad13,16, vilket tyder på en jämförbara väg till inom en infekterad lever.
Innan du utför protokollet, är det viktigt att notera att denna invPCR-analys är en mycket känslig teknik, kan förstärka enstaka kopior av DNA mall. Att begränsa förorening från PCR-produkter är därför av yttersta vikt. Allmänna strategier för att begränsa PCR-produktkontaminering inkluderar följande. a upprätta fysiskt avskilda områden för olika steg i metoden. Varje område bör ha separata lab rockar och handskar ska ändras när du flyttar mellan dessa områden. Vi har listat dessa områden nedan i ordning från mest till minst sannolikt vara smittbärande: PCR-produkt utvinning och sekvensering reaktion uppställningsområdet (post-PCR); PCR-mall tillägg och flammade-pin överföra område (vi har använt PCR huvor med en dekontaminering UV-lampa med gott resultat). DNA-extraktion och inversion området (pre-PCR); och ett ”DNA mall-fri” område används enbart för att förbereda lager och PCR-lösningar. (ii) vara medveten av luftflödet i labbet som en potentiell drivkraft för korskontaminering. I synnerhet förorening av PCR-reaktioner under flammade pin överföring steg är mest sannolikt att uppstå och kommer att leda till felaktiga kvantifiering av integration frekvens. PCR-huvor kan användas för att begränsa dessa cross-strömmar. Negativa kontrollbrunnar (t.ex. Myrcludex B-behandlade prover eller ingen mall kontroller) i PCR kan också användas för att testa för korskontaminering. (iii) begränsar potentiell PCR föroreningar på pipetter och arbete ytor genom att regelbundet torka dem med en lösning för nedbrytning av DNA.
Protokollet anges här arrangeras att upptäcka integration av en känd smittsam HBV klon genereras från den HepAD38 cell linje42. Om den inokulum som används är av en annan HBV-DNA-sekvens (t.ex. från patientens serum), sedan bör HBV genomet sekvenseras för att bekräfta kompatibilitet av PCR primers och inversion design först. I tidigare publicerade studier19, har vi använt 3 uppsättningar av primers som binder bevarade HBV-DNA-sekvenser som flankerar beräknade platsen av HBV-DNA integration korsningar. Andra primer sekvenser och protokoll har beskrivits för att avgöra den genomiska sekvensen av HBV-44,45,46,47,48 och kan arbeta framgångsrikt.
Dessutom kan olika HBV-mottagliga celler (t.ex. primära humana hepatocyter, differentierade HepaRG, HepG2-NTCP celler) användas; Vi har dock funnit att Huh7-NTCP celler ger det största signal-brus-förhållandet, när med tanke på antalet virus-cell DNA korsningar som förstärks jämfört med virus mellanliggande DNA som är förstärkta13. I synnerhet genomgår terminalt differentierade celler som primära humana hepatocyter eller differentierade HepaRG effektivt inte Mitos, vilket resulterar i en hög av amplifiable HBV DNA replikationsförmåga intermediärer kvar i cellerna. Vi har funnit att ~ 90% av förstärkta sekvenser representerar HBV DNA rearrangements (och inte integration händelser) i terminalt differentierade celler, jämfört med 70 – 50% i hepatom cell linjer13. Dessa produkter är i allmänhet HBV DNA genomen som innehåller stora borttagningar i ytan och core öppen läsning ramar, eller de kan representera HBV kvasi arter med en ytterligare Ncojag webbplats före den Sphjag webbplats. Förstärkning av dessa HBV arter (inklusive en principskiss) har beskrivits i detalj tidigare13.
I området i närheten finns det flera nackdelar med denna metod. På grund av mödosamma och flerdagars hur detta protokoll lämpar invPCR sig inte till hög genomströmning analyser av ett stort antal prover. Eftersom det bygger på att begränsa utspädning titrering, är vår metod dessutom inte mycket exakt i kvantifiering; även om det bör enkelt mäta loggnivå förändringar i integration frekvens.
Dessutom är våra inversion protokoll endast lämpad för att upptäcka integrationer mellan regionen DR2 och DR1 av HBV genom, eftersom majoriteten av HBV integrationer inträffar inom denna region49. NGS analys av HBV patienten vävnader har visat att en stor minoritet (upp till ~ 50%) kan också förekomma utanför denna region49. Nya invPCR mönster är teoretiskt kunna upptäcka dessa andra integration webbplatser, även om de inte (såvitt vi vet) har genomförts ännu. Relatedly, på grund av de nödvändiga restriktionsenzym webbplatser krävs nedströms från virus-cell korsningen sekvensen för inversion reaktionen, invPCR inte upptäcker alla integrationer som inträffar inom regionerna DR2 och DR1 HBV genomets (dvs vi har beräknat att ~ 10% av alla integrationer är detekterbara med i silico simuleringar13). När tillämpas på en fokuserad sats av prover med litet numrerar av olika behandlingar, är invPCR dock en av de enda praktiska metoderna för att upptäcka integrerat HBV-DNA på ett enda baspar upplösning.
Därför föreställer vi tillämpningar av denna metod som serverar en viktig roll i att hitta viral (via mutationer av den HBV inokulatet), mobilnät (via knockout eller överuttryck av specifika cellulära gener eller genom tillämpning av olika droger) och miljö ( t.ex. exponering för oxidativ stress) faktorer som inducerar HBV DNA integration. Med denna metod och nyutvecklade HBV infektion system aktivera vi oöverträffad kontroll av dessa faktorer så att de kan vara väl isolerade och bättre karakteriserade. Vi förväntar oss också att detta kommer att leda till en viktig förståelse av cellulära konsekvenserna av HBV-DNA integration, inklusive till vilken utsträckning virala antigener (t.ex. HBx eller HBsAg50) uttrycks från integrerad form, vad styr detta uttryck, och huruvida HBV integration avsevärt ändras den cellulära fenotypen mot ett mer pro-onkogena tillstånd. Resultaten av dessa framtida studier kommer att ha en djupgående inverkan på de terapeutiska strategier som används för att behandla kronisk hepatit B och på den grundläggande förståelsen av själva viruset.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete fick finansiering från tyska centrum för infektion forskning (DZIF), TTU hepatit projekt 5.807 och 5.704, Deutsche Forschungsgemeinschafts (DFG) TRR179 (TP 15), och Australian centrum för HIV och hepatit virologi forskning.
Vi står i skuld till Professor William Mason för hans del i att utveckla den ursprungliga invPCR-metoden och visar det för oss. Vi vill tacka Drs. Yi Ni och Florian A. Lempp för reagenser (cellinjer och HBV inokulum). Vi erkänner Anja Rippert, Franziska Schlund, Sarah Engelhardt och Dr Katrin Schöneweis för tekniskt bistånd. Vi är tacksamma att Miriam Kleinig för korrekturläsning och professorer Nicholas Shackel och Ralf Bartenschlager för kontinuerligt stöd.
Dulbecco’s PBS | PAA | H15-002 | |
DMEM medium | Thermo Fisher Scientific | 41965 | |
Fetal bovine serum | PAA | A15-151 | Heat-inactivate before use |
Penicillin, 10000U/ml; Streptomycin 10mg/ml, 100× | PAA | P11-010 | |
L-glutamine, 200mM | PAA | M11-004 | |
Trypsin, 0.5 mg/ml; EDTA, 0.22mg/ml, 1× | PAA | L11-004 | |
PEG, MW 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | Stock at 40% w/v in 1xPBS, autoclave before use |
DMSO for spectroscopy | Merck | 102950 | |
Tenofovir disoproxil | Sigma-Aldrich | CDS021622 | Dissolve in DMSO |
Lamivudine | Sigma-Aldrich | L1295 | Dissolve in DMSO |
NucleoSpin Tissue kit | Macherey Nagel | 740952.250 | |
NanoDrop 2000/2000c Spectrolphotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
NcoI-HF | NEB | R3193L | |
T4 DNA ligase | NEB | M0202T | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 433209 | |
Dextran (35 -45 kDa) | Sigma-Aldrich | D1662-10G | |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 32205-1L-D | |
BsiHKAI | NEB | R0570L | |
SphI-HF | NEB | R3182L | |
Amplitaq Gold Taq kit | Thermo Fisher Scientific | 4331816 | Use for first nest PCR |
Silicon sealing Mats for 96-Well PCR Plates | Biorad | 2239442 | |
DNAZap PCR DNA Degradation Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9890 | |
96-well PCR plates | Sigma Aldrich | CLS6509 SIGMA | |
96-pin replicator | Thermo Fisher Scientific | 250520 | |
GoTaq Flexi PCR kit | Promega | M8295 | Use for second nest PCR, use green buffer for easy loading of agarose gel |
Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
QIAEX II Gel extraction kit | QIAGEN | 20051 |