نقدم استخدام الفحص المجهري 2-فوتون مكان ميكروبيبيتي داخل الفضاء بومان في المسالك البولية في الفئران، الجمع بين تقنيات التأسيسية 2 الفسيولوجيا الكلوي. استخدام الفحص المجهري 2-فوتون يتغلب على القيود الحرجة للفحص المجهري التقليدي للدراسات فيزيولوجيا الكلي ميكروبونكتوري.
ميكروبونكتوري الكلوية والتصوير 2-فوتون الكلوي تقنيات المنوي في فيزيولوجيا الكلي. ومع ذلك، ميكروبونكتوري محدودة بالاعتماد على الفحص المجهري التقليدي لميزات كليون السطحية، وتقتصر الدراسات 2-فوتون في أنه لا يمكن تقييم التدخلات في الجهاز، بدلاً من مستوى كليون. على وجه الخصوص، قد واجهت تحديات الدراسات ميكروبونكتوري من جلوميرولي الفئران بندرة glomeruli السطحية في الفئران. لمعالجة هذا القيد من أجل مواصلة الدراسات aspirate من الفضاء بومان في النماذج الفسيولوجية الماوس، قمنا بتطوير ميكروبونكتوري 2-فوتون الكبيبي. ونقدم إعداد جراحية رواية التي تسمح بالوصول الأفقي للكلى مع المحافظة على العمود التصوير الرأسي المطلوب للفحص المجهري 2-فوتون. الإدارة من ارتفاع الوزن الجزيئي fluorescein isothiocyanate (فيتك)-ديكستران هو استخدامها لتقديم المفرج الكلوي ومن ثم glomeruli مرئية لتصوير 2-فوتون. ثم قدم ماصة المغلفة دوت كم تحت توجيه المناظير باستخدام الأشعة على الكبيبة اختيارهم من العديد العديد من التي قد يمكن تصور داخل إطار التصوير. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم تفاصيل إعداد المواد والوسائل اللازمة للقيام بهذا الإجراء. ويسهل هذا الأسلوب سابقا من المستحيل دراسة الفسيولوجي الكلي، بما في ذلك استرداد فيلتراتي من الفضاء بومان في وجميع قطاعات كليون حدود عمق التصوير، حوالي 100 ميكرون أسفل الكبسولة الكلوي. الضغط والاتهام وتدفق كل ما يمكن قياس استخدام ماصة أدخلت. هنا، نحن نقدم بيانات تمثيلية من السائل اللوني/قياس الطيف الكتلي على aspirate من الفضاء بومان. ونحن نتوقع هذا الأسلوب إلى انطباق واسع في التحقيق الفسيولوجي الكلي.
والغرض من هذا الإجراء توفير الوصول ميكروبونكتوري الروتينية إلى الفضاء في بومان وغيرها من الهياكل الكبيبي في الفئران. الدراسات ميكروبونكتوري لفيزيولوجيا الكلي كانت محدودة للفحص المجهري 1-فوتون، التي يمكن فقط صورة داخل بضعة ميكرونات من السطح الكلي، والذي يوفر دقة محدودة في z-البعد. نظراً لأن الفئران قد glomeruli السطحية القليلة، أنها ليست دائماً من الممكن العثور الكبيبة سطحية بالفحص المجهري 1 فوتون، ولذلك أجريت معظم الدراسات ميكروبونكتوري في ميونيخ ويستار، الذي قد glomeruli السطحية أكثر عددا. ولذلك، كانت محدودة فوائد العمل في النماذج الماوس في ميكروبونكتوري الدراسات1،،من23. التقدم الذي أحرز مؤخرا في التصوير التكنولوجيات، بما في ذلك،الصغرى-ط45، عززت نانوحبيبات التصوير6، والتصوير الطيف الكتلي7 إلى حد كبير المجموعة من الطرائق المطبقة لفسيولوجيا الكبيبي، ولكن ولا يزال هناك ليس بديلاً عن فريدة من نوعها توفر القدرة على التدخل وعينه أن ميكروبونكتوري. ولتوسيع نطاق استخدام ميكروبونكتوري استخدام التقنيات المعروضة هنا من المتوقع أن يسهل الدراسات فيزيولوجيا الكلي الرواية، على وجه الخصوص، تقييم محتوى filtrate الكلوي (أي، جميع) وعلم وظائف الأعضاء الأساسية من الفئران المعدلة وراثيا، مثل قياسات الضغط filtrate والاتهام، كان يقوم فقط بالنسبة للفئران.
في هذا الأسلوب، يتيح استخدام الفحص المجهري 2-فوتون ميكروبيبيتي الوصول إلى هياكل الكلي يصل إلى حوالي 100 ميكرومتر والتصور أدناه كبسولة الكلي. ولذلك متاحة متعددة (5 – 10) جلوميرولي إلى ميكروبونكتوري في كل الكلي الماوس تصويرها حتى الآن. على الرغم من أن هذا الأسلوب تشاطر بعض الميزات مع ميكروبونكتوري الكلوي التقليدية، وكان المصممة حيثياته وتعديلات واسعة من تقنيات تقليدية مطلوبة. في هذا البروتوكول وإظهار الطموح للسائل من الفضاء بومان في، وإظهار مثال نتائج التحليل اللاحق مع الطيف الكتلي (نانوبروتيوميكس)8،9،،من1011. يتطلب استخدام الطيف الكتلي المصب سير إعداد عينة متخصصة، التي كما يتضح هنا.
نحن نقدم طريقة الوصول إلى الفضاء بومان لمن جلوميرولي غير السطح في الفئران، يسر بالفحص المجهري 2-فوتون. قمنا بتطوير هذا الإجراء لمعالجة قيداً رئيسيا من الكبيبي ميكروبونكتوري، ندرة السطحية glomeruli سعته بالفحص المجهري 1-فوتون في الفئران، بغية تسهيل موضوعي تجريبية والتطلع للسائل من الفضاء بومان لأجل التحليل اللاحق. تطوير وممارسة هذا الأسلوب يعتمد على ست خطوات حاسمة. أولاً، إعداد العمليات الجراحية رواية يجب أن بعناية يتم حيث أن عمود الماء التصوير لا يتم تشغيل إيقاف ساترة وساترة يمتد فوق منطقة الكلي وهو الهدف المتمثل الماصة. ثانيا، يجب تقديم ماصة زجاجية تستخدم ميكروبونكتوري مرئية للفحص المجهري 2-فوتون، الذي يتم إنجازه باستخدام نقاط الكم. تقنية الثالث، والمناظير باستخدام الأشعة مطلوب لدقة موقف ماصة في الفضاء بومان في ثلاثة أبعاد، ما يصل إلى 100 ميكرومتر تحت السطح الكلي. ولذلك، تسجيل تنسيق النظم ماصة والمرحلة بدقة خطوات حاسمة. اختيار الكبيبة الهدف الرابع، والحذر ضروري لضمان وصول الماصة دون اصطدام بهيكل الدعم الكلي والعمود التصوير. وأخيراً، يجب النظر بعناية إلى خطوات تحليلية لمتابعة إجراءات اقتناء، وحجم وتوقيت الحصول على عينات السوائل يجب أن تكون مطابقة للتحليل وفسيولوجيا الكبيبي.
لقد قمنا بتصميم إجراء اكتساب يمكن أن تمتد إلى العديد من التحليلات، بما في ذلك نقاط النهاية ميكروبونكتوري التقليدية، مثل لهب قياس الضوء أو قياسات قطب أيون تراعي قياسات الضغط أو الحجم أو تهمة. بالإضافة إلى ذلك، نعتقد أن هذا الأسلوب سوف تكون قابلة لرواية النهاية تحليلية بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل (ربما بعد النسخ العكسي لميرنا) وجميع مجرى النهر من الطيف الكتلي. التعديلات الخاصة المستخدمة لتسهيل الكتلي تستحق مزيدا من المناقشة، وهي تفرض بعض القيود. أولاً، على الرغم من الطيف الكتلي حساسة للغاية، محتوى البروتين منخفضة وحجم العينات ميكروبونكتوري يجعل تحليل البروتين أدناه النطاق الديناميكي لاستكشاف البروتين التقليدية، ولذلك كانت نانوبروتيوميكس مبسطة الضرورية. 8 , 13 ثانية، لتحسين إنتاج البروتين لفحوصات مبكرة، عقدنا العزم أن nL 200-300 من أسبيراتي ومن الضروري، ولكن حيثياته filtrate اقتناء هذا الحجم سيتطلب ربما ما دامت 20 دقيقة طموح إذا كان الماوس GFR فقط 8-14 nL 3من دور/دقيقة. وكما أظهرت توجو واندو أن تطلع طويلة يغير مضمون ألبومين السائل من أوائل أنبوب الدانية14، انتخبنا لنضح أكثر من 6 دقائق؛ ولكن هذا يعني أن يتجاوز لدينا طموح معدل تدفق فيلتراتي. المستخدمين لهذا الإجراء مدعوة إلى النظر فسيولوجيا الترشيح الكبيبي في نظام تجريبي في تصميم سير العمل الخاصة بهم. أن تطغى الكتلي، تقنية حساسة، بالإشارة من قطارة البترول عرض مثل الزيت المعدني، الذي يستخدم عادة في ميكروبونكتوري لتشمل النظام الهيدروليكي للطموح وعزل قطاعات كليون. ولذلك، نحن لا يمكن استخدام الزيوت المعدنية لهذا الغرض، أو المشتركة الأخرى استخدام، التحديد الكمي لحجم العينات مجموعة نانولتر. بدلاً من ذلك نحن ملء النظام مع بيروفلوروديكالين الذي هو بيولوجيا الخاملة، وعدم الإزعاج الكتلي، والخصائص البصرية الملائمة. ونحن نعتقد القيود المفروضة بموجب بيروفلوروديكالين يمكن التغلب عليها وتعمل على الابتكارات التقنية الإضافية التي نتوقع أن تسمح الحصار الجزء الأنبوبي وقياس حجم العينة.
أجريت معظم الدراسات ميكروبونكتوري في ميونيخ ويستار، التي تبين زيادة في إعداد جلوميرولي السطحية، ولكن هذه الدراسة الفسيولوجية محدودة إلى حد كبير من النقل الأنبوبي وغيرها فيزيولوجيا الكلي بسبب فقدان الأساسية أداة للبيولوجيا الجزيئية، الفئران المعدلة وراثيا2،3. تقنية جديدة لأنه يسهل الوصول إلى الفضاء بومان في الفئران في ميكروبيبيتي، ولذلك يخفف هذه القيود الحرجة. لقد اعتمدنا هذا الأسلوب من أجل الوصول إلى فيلتراتي الكلي لدراسات البروتين باستخدام حساسية عالية الطيف الكتلي، المعروف باسم نانوبروتيوميكس9. ومع ذلك، هناك تطبيقات إضافية المحتمل. على سبيل المثال، دراسة الفسيولوجي الكلي من البروتين التي تمت تصفيتها تم إلى حد كبير ساعد باستخدام تتبع الفلورسنت مع الفحص المجهري 2-فوتون15،،من1617. إضافة ميكروبونكتوري إلى 2-فوتون الفحص المجهري يوفر إمكانية إجراء دراسة الفسيولوجية كليون واحد مع جزيئات الفلورسنت، السماح النيفرون المجاورة، غير حقن بمثابة عناصر التحكم. ونأمل أن تسمح هذه شرح واضح للخطوات الضرورية الاعتماد الواسع النطاق في مختبرات مجهزة بالفعل للفحص المجهري 2-فوتون و/أو ميكروبونكتوري. على الرغم من أنها معقدة، ونحن الآن إجراء هذا الإجراء عدة مرات والتحسينات المقدمة في هذه الوثيقة تمثل أرضية مستقرة لاكتشاف الفسيولوجية.
The authors have nothing to disclose.
نيدك K08 DK090754 إلى GM103493 P41 MPH. نيجمس إلى RDS. هذه المواد هو نتيجة للعمل (بواسطة ميلا في الساعة) الذي كان مدعوما بالموارد واستخدام المرافق المركز الطبي لشؤون قدامى المحاربين في بورتلاند. المحتويات لا تمثل وجهات نظر حكومة الولايات المتحدة أو إدارة شؤون قدامى المحاربين في الولايات المتحدة.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |