Biz böbrek fizyolojisi 2 temel teknikleri birleştirerek farelerde, Bowman’ın idrar alanındaki bir micropipette yerleştirmek için 2-foton mikroskobu kullanımı mevcut. 2-foton mikroskobu kullanılması geleneksel mikroskopi micropuncture böbrek fizyolojisi çalışmaları için kritik sınırlamalar üstesinden gelir.
Böbrek micropuncture ve böbrek 2-foton görüntüleme seminal böbrek fizyolojisi tekniklerdir. Ancak, micropuncture yüzey nefron özelliklerine geleneksel mikroskobu bağımlılığı ile sınırlıdır ve müdahaleler sadece organ, oldukça az nefron düzeyi tespit edilebilir 2-foton çalışmalar sınırlı bulunmaktadır. Özellikle, fareler glomeruli micropuncture çalışmaları farelerde yüzey glomeruli yetersizliği tarafından itiraz edildi. Fare fizyolojik modellerinde Bowman’ın uzaydan aspiratı çalışmaların elde etmek için bu sınırlama adrese 2-foton glomerular micropuncture geliştirdi. Biz 2-foton Mikroskopi için gerekli dikey görüntüleme sütun koruyarak böbrek yanal erişim sağlayan yeni bir cerrahi hazırlık mevcut. Yüksek molekül ağırlıklı floresein isothiocyanate (FITC) İdaresi-dextran böbrek damarlara ve bu nedenle glomeruli 2-foton görüntüleme için görünür işlemek için kullanılır. Bir kuantum pipet nokta kaplı sonra birkaç birçok hangi görüntüleme penceresi içinde görüntülenmeyecektir seçildiği bir glomerulus stereotaksik rehberlik altında tanıttı. Bu protokol için hazırlık, malzeme ve Yöntemler yordamı gerçekleştirmek gerekli ayrıntıları sağlar. Bu teknik filtrate Bowman’ın uzaydan kurtarılması ve nefron görüntüleme derinliği sınırı, böbrek kapsülü altında yaklaşık 100 µm içinde tüm kesimlerini de dahil olmak üzere böbrek, daha önce olanaksız fizyolojik çalışma kolaylaştırır. Basınç, ücret ve akış tüm tanıtılan pipet kullanarak ölçülen. Burada, Sıvı Kromatograflar/Kütle spektrometresi aspiratı Bowman’ın uzaydan üzerinde gerçekleştirilen temsilcisi verileri sağlamak. Böbrek fizyolojik soruşturmada geniş uygulanabilirliği için bu teknik bekliyoruz.
Bu yordamın amacı, Bowman’ın uzay ve glomerular dörtlüleri farelerde rutin micropuncture erişim sağlamaktır. Micropuncture çalışmalar için böbrek fizyolojisi 1-foton mikroskobu, hangi sadece böbrek yüzeyine birkaç mikron içinde görüntü ve hangi z-boyut sınırlı hassasiyet sunar sınırlı olmuştur. Çünkü fareler kaç yüzey glomeruli, her zaman bir yüzey glomerulus 1-foton mikroskobu tarafından bulmak mümkün değildir, bu nedenle en micropuncture çalışmaları daha çok yüzey glomeruli var Münih-Wistar fareler, gerçekleştirilen. Bu nedenle, fare modellerinde çalışmanın faydaları micropuncture çalışmalar1,2,3‘ te sınırlı sahip. Mikro-CT4,5, gibi teknolojiler, Imaging son gelişmeler6görüntüleme ve kütle spektrometresi7 Imaging nanopartikül oldukça gelişmiş yöntemleri glomerular fizyolojisine uygun dizi ama Hayır vekil için eşsiz kalır müdahale ve bu micropuncture örnek için yeteneği sağlar. Bu nedenle burada sunulan yöntemlerle micropuncture kullanımı genişletme roman böbrek fizyolojisi çalışmaları, özellikle böbrek filtrate (Örneğin, metabolomics) içerik ve temel fizyolojisi değerlendirme kolaylaştırmak için bekleniyor transgenik fareler gibi filtrate basınç ve ücret, daha önce sadece fareler gerçekleştirilmiş.
Bu teknikte, renal kapsül görselleştirme ve böbrek yapılarına kadar yaklaşık 100 µm micropipette erişim 2-foton mikroskobu kullanımına izin verir. Birden çok (5-10) glomeruli bu nedenle şu ana kadar yansıma her fare böbrek micropuncture erişilebilir. Her ne kadar bu teknik ile geleneksel böbrek micropuncture bazı özellikleri paylaşır, bu tasarlanmış de novo ve geleneksel teknik kapsamlı bazı değişiklikleri gereklidir. Bu iletişim kuralı biz sıvı aspirasyon Bowman’ın uzaydan göstermek ve kütle spektrometresi (nanoproteomics)8,9,10,11ile daha sonraki analiz sonuçlarını örnek göstermek. Ayrıca aşağıda gösterildiği bir özel örnek hazırlama iş akışı, kütle spektrometresi aşağı akım kullanılması gerekir.
Biz olmayan yüzey glomeruli 2-foton mikroskobu tarafından kolaylaştırdı farelerde Bowman’ın alanı erişmeye yönelik bir yöntem mevcut. Deneysel bir amaç için Bowman’ın uzaydan sıvı aspirasyon kolaylaştırmak amacıyla glomerular micropuncture, yüzey glomeruli adresli 1-foton mikroskobu farelerde, tarafından nadir bir anahtar sınırlaması gidermek üzere bu yordamı geliştirdiğimiz daha sonraki analiz. Geliştirme ve uygulama bu tekniğin altı kritik merdivenlerinde aittir. İlk olarak, yeni cerrahi hazırlık dikkatlice böylece görüntüleme su sütunu coverslip çalışmaz ve coverslip pipet hedefi böbrek alan üzerinde uzanır yapılmalıdır. İkinci olarak, micropuncture için kullanılan Cam Pipet kuantum nokta kullanarak gerçekleştirilir 2-foton mikroskobu görünür işlenmesi gerekir. Üçüncüsü, stereotaktik tekniği tam olarak böbrek yüzeyin 100 µm kadar üç boyutlu Bowman’ın uzayda bir pipet konumlandırmak için gereklidir. Bu nedenle, koordinat sistemleri pipet ve sahne hassasiyetle kayıt önemli adımlardır. Hedef glomerulus dördüncü, dikkatli seçimi için pipet böbrek destek yapısı ve görüntüleme sütun tarafından sıkışma olmadan erişilebilir olduğundan emin olmak gereklidir. Son olarak, satın alma yordamı takip etmek için dikkatli bir değerlendirme analitik adımlarına verilmelidir ve birim ve zamanlama Alım sıvı örneklerini analiz ve glomerular Fizyoloji eşlenmesi gereken.
Alev fotometri, iyon duyarlı elektrot ölçümleri veya basınç, birim veya şarj ölçümleri gibi geleneksel micropuncture bitiş noktaları da dahil olmak üzere birçok analiz için uzatılabilir bir satın alma yordamı dizayn ettik. Ayrıca, bu teknik polimeraz zincir reaksiyonu (Belki de ters transkripsiyon miRNA için takip) ve kütle spektrometresi, aşağı metabolomics da dahil olmak üzere yeni analitik bitiş noktaları için mükellef olacağına inanıyoruz. Kütle spektrometresi kolaylaştırmak için istihdam özel değişiklikler ek tartışma hak ve bazı sınırlamalar empoze. İlk olarak, kütle spektrometresi son derece hassas olmasına rağmen düşük protein içeriği ve micropuncture örnekleri hacmi işler geleneksel proteomik keşif dinamik alan aşağıda protein analizi ve bu nedenle Basitleştirilmiş nanoproteomics vardı gerekli. 8 , 13 ikinci olarak, protein verim erken deneyleri için en iyi duruma getirmek için biz 200-300 nL aspiratı ve gerekli, ama GFR yalnızca 8-14 nL faredir de novo filtrate edinme bu birimin belki sürece aspirasyon 20 dakika gerektirecektir tespit /Min3. Tojo ve Endou uzun süreli aspirasyon erken proksimal tübül sıvı14albümin içeriğini değiştirir gösterildiği 6 dakika boyunca Aspire seçildi; Ancak bu bizim aspirasyon oranı filtrate giriş akımı hızı aşıyor anlamına gelir. Bu yordamı kullanıcılarının kendi iş akışı tasarlama kendi deneysel sisteminde glomerular filtrasyon fizyolojisi düşünmeye teşvik edilmektedir. Kütle spektrometresi, hassas bir teknik, mineral yağ, micropuncture aspirasyon için hidrolik sistemi oluşturan ve nefron parçalarını ayırmak için yaygın olarak kullanılır gibi bir tanıtılan petrol öz sinyalini tarafından boğulmuş. Bu nedenle, biz bu amaç için mineral yağ kullanılamadı veya onun diğer ortak kullanımı, miktar nanoliter aralığı örnekleri hacmi. Bunun yerine sistem hangi biyolojik olarak hareketsiz, kütle spektrometresi rahatsız etmez ve olumlu optik özellikleri olan perfluorodecalin ile doldurun. İnanıyoruz perfluorodecalin tarafından uygulanan sınırlamaları yenilebilir ve beklediğimiz numune hacmi ölçüm ve borulu segmentin abluka sağlayacak ek teknik yenilikler üzerinde çalışıyoruz.
Yüzey glomeruli artan sayıda, ama bu büyük ölçüde sınırlı fizyolojik çalışma borulu taşıma ve diğer böbrek fizyolojisi temel kaybı nedeniyle göstermek Münih-Wistar sıçanlarda en micropuncture çalışmaları gerçekleştirilmiş Aracı moleküler biyoloji, transgenik fareler2,3. Çünkü bu, Bowman’ın uzay farelerde micropipette erişimi kolaylaştırır, roman tekniği bu nedenle kritik bu sınırlamaların etkisini azaltır. Böbrek filtrate nanoproteomics9olarak bilinen yüksek-duyarlı kütle spektrometresi kullanılarak proteomik etütler erişmek için bu teknik edindik. Ancak, büyük olasılıkla ek uygulamalar vardır. Örneğin, filtre uygulanmış protein renal fizyolojik çalışma büyük ölçüde floresan izleyiciler kullanımı ile 2-foton mikroskobu15,16,17ile destekli. Micropuncture 2-foton Mikroskopi için eklenmesi tek-nefron fizyolojik çalışma izin denetimleri hizmet etmek komşu, Sigara enjekte ın floresan molekülleri ile gerçekleştirme imkanı sunuyor. Gerekli adımları net bu açıklama zaten 2-foton mikroskobu ve/veya micropuncture için donatılmış laboratuvarlarında yaygın bir şekilde kabul sağlayacak umulmaktadır. Bu karmaşık olmasına rağmen biz şimdi birçok kez bu yordamı gerçekleştirdiyseniz ve burada sunulan ayrıntılandırmaları fizyolojik keşif için istikrarlı bir platform temsil eder.
The authors have nothing to disclose.
NIDDK K08 DK090754 Mil. NIGMS P41 GM103493 RDSiçin için. Bu malzeme (mil tarafından) büyük kaynaklar ile desteklenen çalışmanın sonucu ve Portland gazileri işleri Tıp Merkezi tesislerinin kullanımı olduğunu. İçeriği US Department of Veterans Affairs veya Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin görüşlerini temsil etmemektedir.
Upright 2 photon microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
3 axis microscope stage controller | Sutter | MP-285 | |
3 axis headstage controller | Sutter | MP-225 | |
Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | |
Headstage | Molecular Devices | CV203BU | |
FITC-dextran 2000 kDa MW | Sigma-Aldrich | 52471-1G | |
borosilicate glass capillary tubes | Sutter | B150-110-7.5 | |
Micropipette puller | Sutter | P-97 | |
Quantum dots, 605 nm | Thermofisher | Q21701MP | |
Polysiloxane | Sugru | No cat number | www.sugru.com, "original formula". Any color. |
PE-50 tubing | Instech Labs | BTPE-50 | |
Microinjector | WPI | UMP-3 | |
Microinjector controller | WPI | Micro4 | |
Perfluorodecalin | Sigma-Aldrich | 306-94-5 | |
Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
Coverslip, 10 mm | Harvard Apparatus | 64-0718 | |
Headplate | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
Head fixation device | Custom | No part number | Common in neuroscience labs, many suppliers |
30 gauge needle | Becton-Dickinson | 125393 | For retroorbital injection |
Tuberculin syringe | Becton-Dickinson | 309626 | For retroorbital injection |