भड़काऊ आंत्र रोग में विरोधी आसंजन चिकित्सा के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए गतिशील आसंजन परख
Summary
पोत दीवार के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं के गतिशील आसंजन आंत होमिंग के लिए एक शर्त है । यहां, हम विरोधी integrin एंटीबॉडी, chemokines या addressin लेपित केशिकाओं का उपयोग कर मानव कोशिकाओं के गतिशील सेल आसंजन पर अंय कारकों के प्रभाव विश्लेषण के लिए इन विट्रो परख में एक कार्यात्मक के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं ।
Abstract
आंत प्रतिरक्षा कोशिकाओं के होमिंग भड़काऊ आंत्र रोगों (आईबीडी) के रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण है । Integrin-निर्भर सेल addressins करने के लिए आसंजन इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है और उपचारात्मक रणनीतियों के साथ हस्तक्षेप कर रहे है सफलतापूर्वक स्थापित किया गया है । विरोधी α4β7 integrin एंटीबॉडी, vedolizumab, Crohn की बीमारी (सीडी) और अल्सरेटिव कोलाइटिस (यूसी) के नैदानिक उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है और आगे यौगिकों का पालन करने की संभावना है ।
आसंजन प्रक्रिया और विरोधी integrin एंटीबॉडी के कार्रवाई तंत्र के विवरण अभी भी कई इस क्षेत्र में कार्यात्मक अनुसंधान के लिए सीमित उपलब्ध तकनीकों के कारण संबंध में अस्पष्ट हैं ।
यहां, हम प्रवाह की स्थिति और आईबीडी के संदर्भ में विरोधी integrin चिकित्सा के प्रभाव के तहत मानव कोशिका आसंजन के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक गतिशील आसंजन परख प्रस्तुत करते हैं । यह वास्तविक समय सूक्ष्म विश्लेषण के साथ addressin-लेपित ultrathin कांच केशिकाओं के माध्यम से प्राथमिक मानव कोशिकाओं के छिड़काव पर आधारित है । परख शोधन और संशोधनों के लिए अवसरों की एक किस्म प्रदान करता है और यंत्रवत खोजों और शोधों अनुप्रयोगों के लिए क्षमता रखती है ।
Introduction
सेल गति एक कसकर विनियमित प्रक्रिया के विकास और बहु सेलुलर जीवों के समारोह के लिए अपरिहार्य है, लेकिन यह भी रोगों की एक भीड़ के रोगजनन में फंसा है1. हाल ही में, परिधीय ऊतकों को रक्त प्रवाह से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की होमिंग प्रक्रिया में वृद्धि हुई है ध्यान, क्योंकि यह भरपाई और immunologically मध्यस्थता रोगों में सूजन ऊतकों में रोगजनक कोशिकाओं के विस्तार के लिए योगदान2 ,3. विशेष रूप से, होमिंग भड़काऊ आंत्र रोगों (आईबीडी) में अनुवाद प्रासंगिकता है दिखाया गया है । चिकित्सकीय विरोधी α4β7 integrin एंटीबॉडी आंत होमिंग के साथ हस्तक्षेप vedolizumab बड़े नैदानिक परीक्षण में प्रभावकारिता दिखाया गया है4,5 और सफलतापूर्वक वास्तविक दुनिया नैदानिक अभ्यास6,7 में इस्तेमाल किया गया है , 8. आगे यौगिकों9,10का पालन करने की संभावना है । इसी प्रकार चिकित्सकीय एंटी-α4 integrin एंटीबॉडी, natalizumab, मल्टीपल स्केलेरोसिस (MS)11के उपचार के लिए प्रयोग किया जाता है ।
हालांकि, हमारे कार्यात्मक होमिंग प्रक्रिया के सामांय में समझ और विशेष रूप से ऐसे चिकित्सीय एंटीबॉडी की कार्रवाई की व्यवस्था अभी भी सीमित है । यह अच्छी तरह से स्थापित है कि होमिंग सेल tethering और अनुवर्ती सेल आसंजन ट्रांस endothelial माइग्रेशन12,13के बाद की गिरफ्तारी के लिए अग्रणी के साथ रोलिंग सहित कई कदम के होते हैं । उपर्युक्त एंटीबॉडी कोशिका पोत दीवार के endothelium पर addressins के साथ बातचीत को रोकने की सतह पर integrins बेअसर । इस फर्म सेल आसंजन14,15में बाधा के लिए सोचा है । फिर भी, हम केवल अलग सेल उपसमुच्चय के सेल होमिंग के लिए विशिष्ट integrins की अंतर प्रासंगिकता को समझने के लिए शुरू कर रहे हैं । इसके अलावा, विभिंन सेल सबसेट और खुराक पर विरोधी integrin एंटीबॉडी के प्रभाव-प्रतिक्रिया संघों काफी हद तक अज्ञात आईबीडी में आंत होमिंग और विरोधी आसंजन चिकित्सा के क्षेत्र में खुले सवालों के बहुत सारे के लिए अग्रणी रहे हैं ।
इसलिए, सुविधाजनक उपकरण ऐसे सवालों के समाधान की सख्त जरूरत है । integrin-addressin बातचीत पर विरोधी integrin एंटीबॉडी का प्रभाव अब तक मुख्य रूप से प्रवाह cytometry के साथ या स्थिर आसंजन परख के माध्यम से बाध्यकारी प्रभावकारिता/बाध्यकारी निषेध का आकलन द्वारा मूल्यांकन किया गया है16,17 ,18,19,20, इस प्रकार स्पष्ट सरलीकरण और शारीरिक स्थिति से विचलन के साथ । हम हाल ही में एक गतिशील आसंजन परख स्थापित करने के लिए मानव कोशिकाओं के integrin पर निर्भर आसंजन addressins और विरोधी के प्रभाव-कतरनी तनाव2के तहत integrin एंटीबॉडी का अध्ययन । तकनीक के सिद्धांत को पहले माउस कोशिकाओं21,22के साथ प्रदर्शन किया गया है । यहां, यह अनुकूलित और विकसित किया गया था उपर्युक्त अनुवाद सवालों का पता, उपंयास रास्ते खोलने के लिए बेहतर विरोधी के साथ चिकित्सा के तंत्र को समझने में vivointegrin एंटीबॉडी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इसके बाद के संस्करण प्रोटोकॉल एक उपयोगी तकनीक का वर्णन करने के लिए मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के गतिशील आसंजन का अध्ययन करने के लिए endothelial लाइगैंडों । लेपित लाइगैंडों की भिन्नता के माध्यम से, perfused सेल प्रक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CN, IA, MFN और SZ के अनुसंधान नैदानिक अनुसंधान के लिए अनुशासनात्मक केंद्र (IZKF) और विश्वविद्यालय के क़िरदार कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था Erlangen-न्यूर्नबर्ग, और Kröner-Fresenius-Stiftung, फ्रिट्ज-शराबी-Stiftung, जर्मन Crohn और कोलाइटिस फाउंडेशन (DCCV), जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) के नैदानिक अनुसंधान समूह CEDER, Microbiota पर DFG विषय कार्यक्रम, उभरते क्षेत्र पहल और DFG सहयोगी अनुसंधान केन्द्रों ६४३, ७९६ और ११८१ ।
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
References
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration – Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -. T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice–a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -. T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
