Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.
Regulering van de chromatine verdichting is een belangrijk proces dat genexpressie in hogere eukaryoten regelt. Hoewel chromatine verdichting en genregulatie expressie zijn vaak verstoord in veel ziekten, heeft een locus-specifieke, endogene en omkeerbare methode te bestuderen en deze controlemechanismen van actie ontbroken. Om aan te pakken dit probleem, hebben wij ontwikkeld en nieuwe gen-regulering bifunctionele moleculen gekenmerkt. Een onderdeel van het bifunctionele molecule bindt aan een DNA-proteïne-anker zodat het naar een allele-specifieke locus zullen worden aangeworven. De andere component bezighoudt endogene cellulaire chromatine-aanpassen machines, werven van deze eiwitten aan een gen van belang. Deze kleine moleculen, chemische epigenetische modifiers (CEMs), genaamd zijn geschikt voor het beheren van genexpressie en de chromatine milieu dosisafhankelijk en omkeerbare wijze. Hier, detail wij een CEM-aanpak en de toepassing ervan om genuitdrukking en Histon staart acetylation op een verslaggever van de groen fluorescente proteïne (GFP) gelegen op het Oct4 locus in muis embryonale stamcellen (mESCs) te verlagen. We karakteriseren de leiding CEM (CEM23) met behulp van fluorescentie microscopie en stroom cytometry chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door een kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR). Terwijl de kracht van dit systeem is gedemonstreerd op de locus Oct4 , conceptueel, de technologie van CEM is modulair en kan worden toegepast in andere celtypes, en op andere genomic loci.
Chromatine bestaat van DNA, histone octamer eiwitten die de kern nucleosoom particle vormen gewikkeld. Regulering van de chromatine verdichting is een essentieel mechanisme voor goede DNA reparatie, replicatie en expressie1,2,3. Unidirectioneel in die cellen het toegangsniveau verdichting is door de toevoeging of verwijdering van verschillende posttranslationele Histon staart wijzigingen. Twee dergelijke wijzigingen omvatten lysine (1) acetylation, die wordt meestal geassocieerd met gene activering, en (2) lysine methylering, die kan worden gekoppeld aan gene activering of onderdrukking, afhankelijk van de context van het aminozuur. De toevoeging van de acetylation en methylation merken wordt gekatalyseerd door Histon acetyltransferases (hoeden) en Histon methyltransferases (HMTs), respectievelijk, overwegende dat de opheffing van het merk wordt gedaan door Histon deacetylases (HDACs) en Histon demethylases (HDMs ), respectievelijk4,5. Hoewel het bestaan van deze eiwitten is gekend voor decennia, veel mechanismen van hoe chromatine-aanpassen machines blijven werken voor het goed regelen van genexpressie vast te stellen. Aangezien chromatine regelgevingsprocessen dysregulated in vele ziekten bij de mens, kunnen nieuwe mechanistische inzichten leiden tot toekomstige therapeutische toepassingen.
De chromatine in vivo test (CiA) is een recent beschreven techniek die een chemische inductor van nabijheid (CIP gebruikt) om controle van machines werving chromatine-aanpassen aan een specifieke locus6. Deze technologie is gebruikt om te bestuderen van een groeiende lijst van chromatine dynamiek, waaronder eiwitten Histon-aanpassen, chromatine remodelers en transcriptie factoren6,7,8,9. CIP gebaseerde chromatine binden van exogenously uitgedrukt eiwitten is ook uitgebreid verleden CiA te moduleren van niet-gemodificeerde genetische loci door gebruik met een gedeactiveerde geclusterd regelmatig Interspaced korte palindromische wordt herhaald CRISPR-geassocieerde proteïne (dCas9) 10 , 11. in het systeem van de CiA, mESCs zijn gewijzigd om een verslaggever GFP-gen op de locus van Oct4 , een zeer uitgesproken en strikt gereguleerde gebied van het genoom mESC express. Eerder, dit systeem is toegepast om te beschrijven de dosisafhankelijk en omkeerbare aanwerving van exogenously uitgesproken heterochromatin eiwit 1 (ML1), een enzym dat bindt H3K9me3 en repressieve merken (bvH3K9me3) wordt doorgegeven en DNA Methylation van6. Om te bereiken dit soort rekruteringsstrategie, zijn de mESCs besmet met een plasmide die een FK506-bindend-proteïne (FKBP), gekoppeld aan een Gal4, die een DNA-proteïne-anker dat zich aan een scala van Gal4-bindende stroomopwaarts van het GFP-verslaggever bindt uitdrukt. De cellen zijn ook besmet met een FKBP-rapamycin-bindend domein (FRB) verbonden met HP1. Wanneer de mESCs worden blootgesteld aan lage nanomolar concentraties van het CIP, rapamycin, zowel FRB en FKBP, zijn samengebracht op de locus van het doel. Binnen enkele dagen van rapamycin behandeling, expressie van het target-gen wordt onderdrukt, zoals blijkt uit de fluorescentie microscopie en stroom cytometry en Histon acetylation daalt, aangetoond door ChIP en bisulfiet sequentiebepaling. Terwijl de ontwikkelings- en valideringsfase van deze aanpak aanzienlijke vooruitgang op het gebied van chromatine onderzoek en regelgeving zijn, een nadeel is de vereiste exogene uitdrukking van chromatine-aanpassen machines.
Te maken van de technologie op basis van werving van alleen endogene fysiologisch relevante enzymen en maken een meer modulair systeem, we ontworpen en gekenmerkt roman bifunctionele moleculen, systemen voor continue emissiemeting (Figuur 1)12genoemd. Een onderdeel van het CEMs bevat FK506 die, vergelijkbaar met rapamycin, strak en specifiek bindt aan FKBP. De CEMs zullen dus nog steeds worden aangeworven om de locus Oct4 in de mESCs van de CiA. De andere component van het CEMs is een groep die endogene chromatine-aanpassen machines bindt. In een pilot-studie, we getest CEMs die HDAC remmers bevatten. Hoewel het concept van het gebruik van een inhibitor van de omwenteling te werven HDACs contra-intuïtief lijkt, is de Inhibitor van de omwenteling toch kunnen aanwerven HDAC activiteit naar het gen van belang. Dit wordt bereikt door (1) het omleiden van de HDAC naar de locus, het vrijgeven van het enzym, en het verhogen van de dichtheid van niet-geremde HDACs in het gebied en (2) handhaving HDAC inhibition op de locus, maar het werven repressieve complexen die zich aan de geremde HDACs binden, of (3) een combinatie van beide. In een eerdere studie, we toonden dat het CEMs kundig voor met succes het onderdrukken van het GFP-verslaggever op een dosis – en tijd-afhankelijke manier, alsmede op een wijze die was snel omkeerbaar (dat wil zeggen, binnen 24 uur)12. We het vermogen van de technologie van de CEM hier gepresenteerd aan controle genexpressie met behulp van fluorescentie microscopie, cytometry van de stroom en de mogelijkheid om te controleren de chromatine-omgeving met behulp van de ChIP-qPCR6gekenmerkt. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik en karakteriseren van het CEMs, die de aanpassing van dit systeem vergemakkelijken zal te beantwoorden van aanvullende vragen met betrekking tot de chromatine biologie.
We beschreven hier, de onlangs ontwikkelde CEM systeem wordt toegepast voor het regelen van genexpressie en chromatine omgeving op een specifiek gen op een dosis-afhankelijke manier. Wij bieden een nauwkeurige methode om te studeren van de dynamiek die betrokken zijn bij het reguleren van de genexpressie door de selectieve aanwerving van specifieke endogene chromatine regelgevende eiwitten. Dit is een zeer modulair technologie die kan worden toegepast om te onderzoeken hoe de verschillende eiwit – en chromatine-aanpassen…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedank de leden van de Hathaway en Jin laboratoria voor hun nuttige discussies. De auteurs worden Dan Crona en Ian MacDonald ook bedanken voor hun kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door Grant R01GM118653 van de Amerikaanse National Institutes of Health (aan N.A.H.); en door subsidies R01GM122749, R01CA218600, en R01HD088626 van de Amerikaanse nationale instituten voor gezondheid (bij J.J.). Dit werk werd ook ondersteund door een tier 3 en een student van het UNC-Eshelman Instituut voor innovatie verlenen (N.A.H en A.M.C, respectievelijk). Extra financiering van een T-32 GM007092 (A.M.C) ondersteund dit werk. Stroom cytometry gegevens is verkregen op de UNC-Stroom Cytometry Core faciliteit gefinancierd door een P30 CA016086 Cancer Center Core ondersteuning subsidie aan de UNC-Lineberger uitgebreide Cancer Center.
DMEM | Corning | 10-013CV | |
NEAA | Gibco | 11140-050 | |
HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
(ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
Sonicator | Covaris | E110 | |
Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
PBS | Corning | 46-013-CM | |
BSA | Fisher | BP9700 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
EDTA | Fisher | S311-100 | |
NaCl | Fisher | S271-1 | |
Glycerol | Fisher | G33-1 | |
Tris | Fisher | BP152 | |
NP40 | Roche | 11754599001 | |
Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
Glycine | Fisher | BP381-500 | |
TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |