Repressing Gene transkripsjon av omadresserer cellulære maskiner med kjemiske Epigenetic modifikatorer
Summary
Regulering av chromatin miljøet er en viktig prosess kreves for riktig genuttrykk. Her vi beskriver en metode for å kontrollere genuttrykk gjennom rekrutteringen av chromatin-modifisere maskiner i en gen-spesifikke og reversibel måte.
Abstract
Regulering av chromatin komprimering er en viktig prosess som styrer genuttrykk i høyere eukaryoter. Selv om chromatin komprimering og gene expression regulering er ofte forstyrret i mange sykdommer, har locus-spesifikke endogene og reversibel metode å studere og kontrollere disse virkningsmekanismer manglet. For å løse dette problemet, har vi utviklet og preget romanen gen-regulere bifunctional molekyler. Én komponent av bifunctional molekyl bindes til en DNA-protein anker slik at det vil bli rekruttert til en allel-bestemte locus. Den andre komponenten engasjerer endogene mobilnettet chromatin-modifisere maskiner, rekruttere disse proteinene til en genet av interesse. Disse små molekyler, som kalles kjemiske epigenetic modifikatorer (CEMs), er i stand til å kontrollere genuttrykk og chromatin miljø i en doseavhengig og reversibel måte. Her, detalj vi en CEM tilnærming og dens anvendelse å redusere genuttrykk og histone hale acetylation på grønn fluorescerende Protein (GFP) reporter på Oct4 locus i mus embryonale stamceller (mESCs). Vi karakteriserer ledelsen CEM (CEM23) med fluorescerende mikroskopi, flowcytometri og chromatin immunoprecipitation (ChIP), etterfulgt av en kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR). Mens kraften i dette systemet er demonstrert på Oct4 locus, konseptuelt, CEM teknologien er modulære og kan brukes i andre celletyper og andre genomisk loci.
Introduction
Chromatin består av DNA pakket rundt histone octamer proteiner som danner kjernen nucleosome partikkel. Regulering av chromatin komprimering er en viktig mekanisme for riktig DNA reparasjon, replikering og uttrykk1,2,3. En måte som cellene kontrollere nivået av komprimering er gjennom tillegging eller fjerning av ulike post-translasjonell histone hale modifikasjoner. To slike endringer inkluderer (1) lysin acetylation, som er oftest assosiert med gene aktivisering, og (2) lysin metylering, som kan være assosiert med gene aktivisering eller undertrykkelse, avhengig av aminosyre konteksten. Tillegg av acetylation og metylering merkene er katalysert av histone acetyltransferases (luer) og histone methyltransferases (HMTs), henholdsvis, mens fjerning av merket gjøres ved histone deacetylases (HDACs) og histone demethylases (HDMs ), henholdsvis4,5. Selv om eksistensen av disse proteinene har vært kjent i flere tiår, mange mekanismer av hvordan chromatin-modifisere maskiner fungerer å riktig regulere genuttrykk gjenstår for å defineres. Siden chromatin lovgivende prosesser er dysregulated i mange menneskelige sykdommer, kan ny mekanistisk innsikt føre til fremtidige terapeutiske programmer.
Chromatin i vivo analysen (CiA) er en nylig beskrevet teknikk som bruker en kjemisk induser av nærhet (CIP) til å kontrollere chromatin-modifisere maskiner rekruttering til en bestemte locus6. Denne teknologien har blitt brukt til å studere et voksende liste av chromatin dynamikk, inkludert endring av histone proteiner, chromatin remodelers og transkripsjon faktorer6,7,8,9. CIP-baserte chromatin tethering exogenously uttrykt proteiner har også blitt utvidet tidligere CiA å modulere ingen-modifisert genetisk loci ved bruk med en deaktivert gruppert regelmessig Interspaced kort Palindromic gjentar CRISPR-assosiert protein (dCas9) 10 , 11. i CiA systemet, mESCs er endret for å uttrykke en GFP reporter genet på Oct4 locus, et svært uttrykt og strengt regulert område av mESC genomet. Tidligere dette systemet brukes for å beskrive doseavhengig og reversibel rekruttering exogenously uttrykt heterochromatin protein 1 (HP1), et enzym som binder H3K9me3 og overfører undertrykkende merker (f.eksH3K9me3) og DNA metylering6. For å oppnå denne typen rekrutteringsstrategi, er mESCs infisert med en plasmider som uttrykker en FK506-binding protein (FKBP) koblet til en Gal4, som er en DNA-protein som binder en Gal4-binding rekke oppstrøms GFP reporter. Cellene er likeledes infisert med et FKBP-rapamycin-bindende domene (FRB) koblet til HP1. Når mESCs er utsatt for lav nanomolar konsentrasjoner av CIP, samles rapamycin, både FRB og FKBP, på målet locus. Uttrykk for målet genet er undertrykt, som dokumentert av fluorescens mikroskopi og flyt cytometri dagers rapamycin behandling, og histone acetylation er redusert, vist av ChIP og bisulfite sekvensering. Mens utvikling og validering av denne tilnærmingen har vært betydelige fremskritt innen chromatin forskning og regulering, ettall ulempen er nødvendig ytre uttrykk for chromatin-modifisere maskiner.
Å få basert på rekruttering av bare endogene fysiologisk relevante enzymer og lage et mer modulsystem, vi designet og preget romanen bifunctional molekyler, kalt CEMs (figur 1)12. En del av CEMs inkluderer FK506 som ligner på rapamycin, binder tett og spesielt til FKBP. Dermed vil i CEMs fortsatt bli rekruttert til Oct4 locus i CiA mESCs. Den andre komponenten av CEMs er en moiety som binder endogene chromatin-modifisere maskiner. I en pilotstudie testet vi CEMs som inneholder HDAC hemmere. Selv om konseptet med å bruke en inhibitor for å rekruttere HDACs synes counter-intuitive, er inhibitor likevel kunne rekruttere HDAC aktiviteten til genet av interesse. Dette oppnås ved å (1) omdirigere HDAC til locus, slippe enzymet, og øker tettheten av un hemmet HDACs i området og (2) opprettholde HDAC hemming på locus, men rekruttere undertrykkende komplekser som binder seg til de hemmet HDACs, eller (3) en kombinasjon av begge. I en tidligere studie, vi viste at CEMs kunne med hell undertrykke GFP reporteren i en dose – og tidsavhengige måte og på en måte som var raskt reversibel (dvs., innen 24 timer)12. Vi preget evne til CEM teknologien presentert her for kontroll genuttrykk bruker fluorescens mikroskopi, flowcytometri og muligheten til å kontrollere chromatin miljøet bruker ChIP-qPCR6. Her beskriver vi en metode for å bruke og karakteriserer CEMs, som vil lette tilpasning av dette systemet for å svare på flere spørsmål knyttet til chromatin biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskrev vi nylig utviklet CEM systemet brukes for å regulere genuttrykk og chromatin miljø på et bestemt gen i en doseavhengig måte. Vi gir en nøyaktig metode for å studere dynamikken involvert i å regulere genuttrykk gjennom selektive rekrutteringen av bestemte endogene chromatin regulatoriske proteiner. Dette er en svært modulær teknologi som kan brukes til å undersøke hvordan forskjellige protein – og chromatin-modifisere komplekser jobber sammen å riktig regulere chromatin miljøet, samt for å studer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av Hathaway og Jin laboratoriene for diskusjonene nyttig. Forfatterne takker også Dan Crona og Ian MacDonald for deres kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet var støttes delvis av Grant R01GM118653 fra det amerikanske National Institutes of Health (til N.A.H.); og av tilskudd R01GM122749, R01CA218600 og R01HD088626 fra det amerikanske nasjonalt institutter for helse (til JJ). Dette arbeidet ble også støttet av et nivå 3 og student grant fra UNC Eshelman Institutt for innovasjon (N.A.H og A.M.C, henholdsvis). Ytterligere midler fra en T-32 GM007092 (til A.M.C) støttet dette arbeidet. Flow cytometri data ble oppnådd ved UNC Flow cytometri Core anlegget finansiert av en P30 CA016086 Cancer Center Core støtte stipend for UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center.
Materials
| DMEM | Corning | 10-013CV | |
| NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| HEPES (for tissue culture) | Corning | 25-060-Cl | |
| BME (2-Mercaptoethanol) | Gibco | 21985-023 | |
| FBS | Atlantic Biologicals | S11550 | Individual lots tested for quality |
| Covaris tubes | ThermoScientific | C4008-632R | |
| Covaris caps | ThermoScientific | C4008-2A | |
| PEI (polyethylenimine) | Polysciences | 23966-1 | |
| Transfection media (Opti-mem) | Gibco | 31985070 | |
| Virus centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Virus filter membrane | Corning | 431220 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology | SC134220 | |
| 0.25 % Trypsin | Gibco | 25200-056 | with EDTA |
| 0.05 % Trypsin | Gibco | 25400-054 | with EDTA |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr | |
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl | |
| SYBR Green Master Mix (asymmetrical cyanine dye) | Roche | 4913914001 | |
| H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| (ChIP kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit | Active Motif | 53040 | |
| Sonicator | Covaris | E110 | |
| Ultracentrifuge | Optima | XPN-80 | |
| SW-32 centrifuge rotor | Beckman Coulter | 14U4354 | |
| SW-32 Ti centrifuge buckets | Beckman Coulter | 130.2 | |
| LentiX 293 Human Embryonic Kidney | Clontech | 632180 | |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BSA | Fisher | BP9700 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| EDTA | Fisher | S311-100 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| Glycerol | Fisher | G33-1 | |
| Tris | Fisher | BP152 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| Triton | MP Biomedicals | 807426 | |
| Glycine | Fisher | BP381-500 | |
| TE buffer | Fisher | BP2474-1 | |
| HEPES (for ChIP) | Fisher | BP310-100 | |
| Gelatin | Sigma | G1890 | |
| Flow cytometer, Attune NxT | Thermo Fisher | A24858 | |
| FKBP-Gal4 plasmid | Addgene | 44245 | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G plasmid | Addgene | 12259 | |
| Nanodroplets | MegaShear | N/A | |
| DNA Nanodrop | Thermo Fisher | ND1000 | |
| Protease Inhibitors (Leupeptin) | Calbiochem/EMD | 108975 | |
| Protease Inhibitors (Chymostatin) | Calbiochem/EMD | 230790 | |
| Protease Inhibitors (Pepstatin) | Calbiochem/EMD | 516481 | |
| CiA:Oct4 mESC | The kind gift of G. Crabtree | ||
| Lif-1C-alpha – producing Cos cells | The kind gift of J. Wysocka |
References
- Alabert, C., Groth, A. Chromatin replication and epigenome maintenance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 153-167 (2012).
- Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (3), 178-189 (2015).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Gräff, J., Tsai, L. -. H. Histone acetylation: molecular mnemonics on the chromatin. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 97-111 (2013).
- Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (4), 258-264 (2015).
- Hathaway, N. A., et al. Dynamics and memory of heterochromatin in living cells. Cell. 149 (7), 1447-1460 (2012).
- Ren, J., Hathaway, N. A., Crabtree, G. R., Muegge, K. Tethering of Lsh at the Oct4 locus promotes gene repression associated with epigenetic changes. Epigenetics. 13 (2), 173-181 (2018).
- Stanton, B. Z., Hodges, C., et al. Smarca4 ATPase mutations disrupt direct eviction of PRC1 from chromatin. Nature Genetics. 49 (2), 282-288 (2017).
- Koh, A. S., Miller, E. L., et al. Rapid chromatin repression by Aire provides precise control of immune tolerance. Nature Immunology. 19 (2), 162-172 (2018).
- Chen, T., Gao, D., et al. Chemically Controlled Epigenome Editing through an Inducible dCas9 System. Journal of the American Chemical Society. 139 (33), 11337-11340 (2017).
- Braun, S. M. G., et al. Rapid and reversible epigenome editing by endogenous chromatin regulators. Nature Communications. 8 (1), 560 (2017).
- Butler, K. V., Chiarella, A. M., Jin, J., Hathaway, N. A. Targeted Gene Repression Using Novel Bifunctional Molecules to Harness Endogenous Histone Deacetylation Activity. ACS Synthetic Biology. 7 (1), (2018).
- Kasoji, S. K., et al. Cavitation Enhancing Nanodroplets Mediate Efficient DNA Fragmentation in a Bench Top Ultrasonic Water Bath. PLoS ONE. 10 (7), 0133014 (2015).
- Chiarella, A. M., et al. Cavitation enhancement increases the efficiency and consistency of chromatin fragmentation from fixed cells for downstream quantitative applications. Biochemistry. 57 (19), 2756-2761 (2018).
- Gao, Y., et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods. 13 (12), 1043-1049 (2016).
