एक microbioreactor प्रणाली में विभिंन स्थितियों के तहत ४८ समानांतर सेल संस्कृतियों के समवर्ती आपरेशन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । सेल कल्चर प्रोसेस, हार्वेस्ट और बाद में एंटीबॉडी titer एनालिसिस बताए गए हैं ।
स्वचालित अतिसूक्ष्म (15 मिलीलीटर) सेल संस्कृति इंजीनियरों के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है । वे प्रयोगात्मक शर्तों की एक विस्तृत विविधता के एक साथ निष्पादन की सुविधा है, जबकि संभावित प्रक्रिया परिवर्तनशीलता ंयूनतम । इस दृष्टिकोण के अनुप्रयोगों में शामिल हैं: क्लोन स्क्रीनिंग, तापमान और पीएच बदलाव, मीडिया और पूरक अनुकूलन । इसके अलावा, छोटे रिएक्टर संस्करणों के प्रयोगों के बड़े डिजाइन कि स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला की जांच करने के लिए अनुकूल हैं । यह ऊपर की प्रक्रियाओं को काफी स्केल-अप से पहले अनुकूलित किया जा करने की अनुमति देता है, जहां प्रयोग समय और आर्थिक बाधाओं के कारण क्षेत्र में अधिक सीमित है । स्वचालित अतिसूक्ष्म के लिए इस तरह के एक शेक कुप्पी या स्पिनर कुप्पी के रूप में पारंपरिक छोटे पैमाने पर सेल संस्कृति इकाइयों, पर विभिन्न लाभ प्रदान करते हैं । हालांकि, के दौरान पायलट स्केल प्रक्रिया विकास महत्वपूर्ण देखभाल सुनिश्चित करने के लिए कि इन लाभों का एहसास कर रहे है लिया जाना चाहिए । जब देखभाल के साथ चलाने के लिए, सिस्टम उच्च स्तर स्वचालन सक्षम कर सकते हैं, चर के एक उच्च संख्या के साथ डो के चलाने के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है और जब एक पोषक तत्व विश्लेषक या सेल काउंटर के साथ एकीकृत नमूना समय को कम कर सकते हैं । विशेषज्ञ-व्युत्पंन अनुमानियों के एकीकरण यहां प्रस्तुत वर्तमान स्वचालित अतिसूक्ष्म के साथ, आम नुकसान है कि सार्थक परिणाम बाधा कम कर सकते हैं । चरम में, यहां रखी सिद्धांतों का पालन करने में विफलता उपकरण नुकसान है कि महंगी मरंमत की आवश्यकता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, microbioreactor प्रणालियों छोटे संस्कृति सेल संस्कृति की स्थिति का लक्षण वर्णन करना मुश्किल मात्रा में है । संख्या और नमूनों की मात्रा में लिया-प्रक्रिया बैच मोड संस्कृति में सीमित है के रूप में ऑपरेटिंग वॉल्यूम 10 मिलीलीटर से नीचे गिर नहीं कर सकता । इस विधि अतिसूक्ष्म के लाभ और कमियों पर चर्चा करेंगे ।
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) पहले १९७५1में माउस hybridoma कोशिकाओं में उत्पादित किया गया । तब से, रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन के विकास में वृद्धि हुई है मानवीयकरण mAbs के लिए जगह ले ली है vivo सुरक्षा और प्रभावकारिता2,3,4में वृद्धि हुई है । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन प्रक्रियाओं के अधिकांश आसानी जिसके साथ वे सीरम मुक्त मीडिया के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए चीनी हंसटर अंडाशय (चो) कोशिकाओं को रोजगार, उनके समान एक सहज मानव की है कि इसी तरह के बाद अनुवाद संशोधनों के साथ प्रोटीन का उत्पादन करने की क्षमता प्रोटीन और मेजबान कोशिकाओं के रूप में उनकी निर्भरता5,6।
मांग तेजी से उत्पाद देने के लिए बढ़ रहा है, और लगातार गुणवत्ता के साथ बड़ा रोगी आबादी के लिए । आर्थिक लाभ के अलावा, mAbs द्वारा इलाज किया रोगों की प्रदर्शनियों की वृद्धि, जो अब स्व-प्रतिरक्षित रोग, बाद प्रत्यारोपण जटिलताओं, गठिया, और7कैंसर भी शामिल है । आधुनिक वाणिज्यिक मॉब उत्पादन लाइनों के लिए औसत पैदावार आम तौर पर 5-6 g/L की सीमा में है और5वृद्धि जारी है । भाग में, यह है चो सेल इंजीनियरिंग के माध्यम से पूरा किया गया है और बेहतर उत्पादन लाइन उच्च प्रवाह का उपयोग कर स्क्रीनिंग8प्रतिक्रिया । हालांकि, प्रोटीन के उत्पादन में सबसे अधिक वृद्धि की प्रक्रिया में सुधार के लिए जिंमेदार ठहराया गया है, मीडिया अनुकूलन, सेल संस्कृति की स्थिति में प्रगति सहित, और बेहतर खिला रणनीतियों7,9,10। पोषक तत्वों की पूरकता न केवल उचित सेल विकास के लिए बल्कि उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन के कुशल उत्पादन के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, कोशिकाओं विशिष्ट पोषक तत्वों के stoichiometric अलावा की आवश्यकता होती है, रणनीति अनुकूलन6,11खिलाने के लिए अतिरिक्त समझ की आवश्यकता होती है । पारंपरिक अनुकूलन तरीकों व्यक्तिगत मीडिया घटक अनुमापन और मिश्रण डिजाइन के साथ मीडिया सम्मिश्रण शामिल हैं । हालांकि, इन तरीकों समय लगता है, श्रम गहन, और मानव त्रुटि12,13के साथ जुड़े जोखिम शामिल हैं ।
मीडिया अनुकूलन अध्ययन पहले से हिला कुप्पी और 1-2 एल प्रतिक्रियाएं जो कच्चे माल और मानव पूंजी के मामले में महंगा हो सकता है नकारात्मक स्तर तक पर भरोसा किया । Microplates भी इस्तेमाल किया गया है लेकिन इन तरीकों सीमित दरिद्रता प्रदान करते हैं । इसके अलावा, यह अभी भी एक से अधिक समय लेने वाली रन की आवश्यकता हो सकती है कि बैच-से-बैच परिवर्तनशीलता जो CQA मीडिया संरचना और खिला रणनीति14,15,16के कारण परिवर्तनशीलता अस्पष्टता परिचय । इस प्रकार, उच्च प्रवाह और अति सुसंगत समानांतर प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए की जरूरत17,18,19,20उभरा ।
पारंपरिक पीठ पैमाने पर जैव प्रतिक्रिया (0.5-5 एल) के संचालन के साथ जुड़े महत्वपूर्ण खर्च के साथ, microbioreactors जैविक रूप से प्राप्त दवाओं के उत्पादन का आकलन करने के लिए एक लागत को कम करने के विकल्प प्रदान करते हैं । 21 बेंच स्केल उभारा-टैंक प्रतिक्रिया भरोसेमंद और संवेदी arrays के माध्यम से घने डेटा प्रदान कर रहे हैं । प्रतिक्रिया नियंत्रण प्रणालियों आपरेशन के आसान निरीक्षण के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, विधानसभा, अंशांकन, सफाई, श्रम लागत, सब्सट्रेट लागत, और नसबंदी आवश्यकताओं को बेंच-स्केल उभारा-टैंक विरोधी प्रतिक्रियाएँ महँगी और परिश्रम करने के लिए गहन श्रम करते हैं. हिला कुप्पी और microtiter प्लेटें बड़े पैमाने पर प्रतिक्रिया के साथ जुड़े लागत और श्रम समस्याओं में से कुछ को हटा दें, लेकिन इन विकल्पों प्रसंस्करण शर्तों पर कमजोर नियंत्रण प्रदान करते हैं और कम घनत्व डेटा का उत्पादन, अक्सर ही अंत बिंदु माप. 22
वैकल्पिक रूप से, microbioreactors सेल लाइन और ऊपर की प्रक्रिया के विकास के लिए एक स्केल-डाउन दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए एक छोटे से काम की मात्रा का उपयोग । microbioreactor प्रयोगों के पैमाने पर काफी बिजली, सब्सट्रेट, श्रम, अंतरिक्ष, और उपयोगिताओं के कम उपयोग के माध्यम से लागत चल कम कर सकते हैं. 23 Microbioreactors कि वे अपने आकार के कारण संभाल करने के लिए आसान कर रहे है में हिला कुप्पी की तरह हैं, लेकिन वे अपने पीएच, तापमान, भंग ऑक्सीजन के ऑनलाइन प्रतिक्रिया नियंत्रण के माध्यम से पारंपरिक बेंच पैमाने पर प्रतिक्रिया के लाभ बनाए रखने, और एसिड/ खपत के रूप में अच्छी तरह से उनकी वास्तविक समय बंद गैस संरचना सहित गुणवत्ता मानकों के डेटा उत्पादन । Microbioreactor स्केल उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग क्षमता है, जो क्लोन चयन और प्रक्रिया के विकास के लिए उपयोगी हो सकता है के लिए अनुमति देता है । 24
उंनत अतिसूक्ष्म प्रतिक्रिया चो सेल संस्कृति प्रक्रिया लक्षण वर्णन और18विकास के लिए एक प्रभावी उपकरण हो दिखाया गया है । इस के साथ साथ, एक स्वचालित ambr15 प्रणाली, समानांतर में ४८ microbioreactors से मिलकर, कि अध्ययन के ऊपर पैमाने में शास्त्रीय उभार टैंक रिएक्टरों के तुलनीय होना दिखाया गया है,25 एक पूर्व काम है कि मीडिया को अनुकूलित के अनुरूप तरीके से इस्तेमाल किया गया था एक चो-DG44 सेल लाइन के लिए संरचना एक मॉडल chimeric IgG16उत्पादन । विकास और titer पर बदलती मीडिया स्थितियों के प्रभाव की तुलना की गई, और विश्लेषण किया गया । इस पत्र में microbioreactor प्रणाली चलाने के लिए एक सामान्य दिशानिर्देश और क्रूड मीडिया के नमूनों का विश्लेषण प्रस्तुत किया गया है.
स्वचालित सूक्ष्म प्रतिक्रिया प्रणाली चलाने के ठीक से और कुशलता से कई स्वचालित चरणों के समय पर निष्पादन शामिल है । सिस्टम चलाने का सबसे महत्वपूर्ण भागों में से एक सॉफ्टवेयर प्रोग्रामिंग है । यदि प्रोग्राम लिखते समय कोई त्रुटि हो, तो इस प्रयोग में गंभीर त्रुटियां हो सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप प्रक्रिया में अप्रत्याशित परिवर्तन हो सकते हैं, खिलाने की रणनीति, नमूना रणनीति, या अंतिम उत्पाद की गुणवत्ता जो अध्ययन के निष्कर्षों को अमान्य कर सकती है । प्रणाली चलाने का एक अंय महत्वपूर्ण पहलू को जगह है और सही ढंग से दबाना प्लेट को मजबूत करने के लिए उचित नियंत्रण सुनिश्चित करना है । दबाना प्लेट असमान किया गया है कि सबसे आम संकेत 1, 6, 7 और 12 (कोने रिएक्टर जहाजों) जहाजों के लिए माप में अप्रत्याशित भिन्नता है । कुल मिलाकर अस्थिरता दबाना प्लेटों में गैस प्रवेश लाइनों में गैसकेट की एक ढीला इंगित करता है । इस परिदृश्य में कर सेट बिंदु तक पहुंचने में बाधा हो सकती है । एक अंय आम ख़तरा से बचने के लिए जब एक प्रयोग शुरू करने दे रहा है कोशिकाओं टीका कदम के दौरान भी लंबे समय बैठते हैं, उंहें बसने के कारण । कम समय कोशिकाओं बैठे खर्च करते हैं, कम मौका है कि उत्तरोत्तर कम इनोक्युलम कोशिका गिनती रिएक्टर जहाजों जो महत्वपूर्ण पूर्वाग्रह है कि अनजाने में अध्ययन के परिणाम को नुकसान पहुंचा सकते है के लिए क्रमिक रूप से जोड़ रहे हैं । यह कई चरणों में inoculate करने के लिए बेहतर है, यानी inoculate प्रत्येक संस्कृति स्टेशन के बीच में ठहराव चरणों के साथ एक के बाद एक तो कोशिकाओं टीका थाली में 15 मिनट से अधिक समय के लिए नहीं बैठे हैं ।
दिन के लिए दिन के उपयोग के विषय में, बाँझ बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि प्रणाली एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में है, बाँझ में और हुड के बाहर अक्सर आंदोलन के कारण की गारंटी नहीं है । नतीजतन, डाकू में चला जाता है कि सब कुछ ७०% आइपीएल के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए । दूसरे, यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि न्यूनतम फोम संस्कृति के दौरान होता है; मीडिया बक और निकास लाइनों को रोकना, क्लैंप प्लेट के नुकसान के लिए अग्रणी और यहां तक कि कोर घटक नीचे कर सकते हैं । निवारक विरोधी फोम इसके अलावा कदम किसी भी सूक्ष्म प्रतिक्रिया कार्यक्रम डिजाइन में महत्वपूर्ण हैं । एक “बाहर फोम” यह प्रोटोकॉल सफाई निर्माताओं का पालन करें और दबाना प्लेटों की स्थाई क्षति को रोका जा सकता है लाभप्रद होगा की स्थिति में । वैकल्पिक रूप से, गैर sparged वाहिकाओं का उपयोग कम सेल घनत्व के लिए फायदेमंद हो सकता है या मात्रा अनुपात के लिए उच्च सतह के रूप में बैच मोड में चल रहा है जब भी एक sparger की कमी के साथ कुशल ऑक्सीजन सक्षम बनाता है. हालांकि, गैर sparged जहाजों के लिए उच्च कोशिका घनत्व या छिड़काव संस्कृतियों के लिए उपयोगी नहीं हो सकता है के रूप में सिर अंतरिक्ष ऑक्सीजन की बढ़ती खपत संस्कृतियों के साथ रखने के लिए अपर्याप्त है ।
वहां कई microbioreactor प्रणाली द्वारा प्रदान की लाभ कर रहे हैं, क्योंकि यह कई नियंत्रित संस्कृतियों के समानांतर में एक छोटे पैमाने पर हिला कुप्पी से अधिक नियंत्रण के साथ चलाने के लिए सक्षम बनाता है । 17 इसलिए, सिस्टम स्क्रीनिंग अध्ययन के निष्पादन की सुविधा, करता है, उच्च प्रवाह क्लोन अध्ययन और अभिकर्मक अध्ययन । स्वचालित तरल हैंडलिंग भी विश्लेषक के लिए विश्लेषक परिवर्तनशीलता कम कर देता है, जबकि एक साथ थकाऊ और समय से कम करने के लिए प्रशिक्षित कर्मियों के लिए गहन परिश्रम । जबकि वहां प्रणाली के लिए कई फायदे हैं, वहां कई महत्वपूर्ण नुकसान है कि विचार किया जाना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, 15 मिलीलीटर की एक संस्कृति मात्रा में काफी सीमा-प्रक्रिया नमूना और अंतिम फसल सामग्री, और कई वैकल्पिक छोटे पैमाने पर (५०० एमएल तक) प्रतिक्रिया हाल ही में उपलब्ध हो गया है । प्रणाली के लिए एक हाल ही में प्रगति है जैव प्रोफ़ाइल नोवा बायोमेडिकल से 2 विश्लेषक, जो प्रक्रिया में सेल घनत्व और पोषक तत्व विश्लेषण के लिए नमूना मात्रा को कम करने के मुद्दे के नमूने के साथ स्वचालित अतिसूक्ष्म के एकीकरण के साथ प्रतिक्रिया . लाभ जल्दी सेटअप और लगभग कोई परिचालन बचत के लिए अग्रणी सफाई शामिल कर सकते हैं, लेकिन प्रयोज्य इकाइयों की लागत दीर्घकालिक परियोजनाओं के लिए विचार किया जाना चाहिए क्योंकि यह महंगा हो सकता है के लिए पुन: प्रयोज्य पारंपरिक प्रणालियों से इकाइयों की खरीद ।
इस पत्र में चर्चा की विधि बैच मोड सेल संस्कृति के लिए मुख्य रूप से उपयुक्त है, लेकिन उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है । प्रत्येक संस्कृति स्टेशन तापमान के स्वतंत्र नियंत्रण है, जबकि करते हैं और पीएच व्यक्तिगत रिएक्टर जहाजों के स्तर पर विविध किया जा सकता है । Sartorius भी डो योजना सॉफ्टवेयर विशेष रूप से डिजाइन करने के लिए प्रयोग की अनुमति प्रदान करता है सूक्ष्म प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए सिलवाया सकता है । बड़े पैमाने पर डो नए निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर अध्ययन मीडिया और पूरक अनुकूलन में मदद कर सकते हैं । हालांकि यहां इस्तेमाल नहीं, microbioreactor प्रणाली भी फेड बैच अध्ययन सक्षम बनाता है । सिस्टम अभी तक छिड़काव सेल संस्कृतियों के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है । हालांकि, वहां सीमित अध्ययन और परीक्षण के लिए वर्तमान सूक्ष्म प्रतिक्रिया प्रणाली में छिड़काव सेल संस्कृति आपरेशन नकल गया है । 26 इस विधि सेल बसने के द्वारा उच्च घनत्व छिड़काव संस्कृतियों की नकल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । ऊंचाई जो करने के लिए प्लास्टिक रिएक्टर में डाला जाता है और निपटाने के समय को अनुकूलित द्वारा बदलती द्वारा, मीडिया और हटाया जा सकता है के लिए संस्कृति की फले मोड दर्पण मंगाया । इस विकासशील क्षेत्र में नए उत्पादों रहे है कि यहां प्रस्तुत प्रणाली अगर संस्कृति के छिड़काव मोड वांछित है से बेहतर काम कर सकते हैं ।
सारांश में, इस अध्ययन स्वचालित सूक्ष्म-प्रतिक्रिया और चो सेल संस्कृति के संचालन के लिए विश्लेषणात्मक जुड़े का उपयोग करने के लिए उत्पादन और एक मॉडल IgG1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशेषताएं दर्शाता है । यह भूमिका पर जोर देती है छोटे पैमाने पर सूक्ष्म-प्रतिक्रिया के लिए उत्पादन में खेल विनिर्माण और सेल संस्कृति विकास और मीडिया स्क्रीनिंग पर उनके प्रभाव । जबकि वहां एक स्वचालित छोटे पैमाने प्रणाली का उपयोग करने के लिए कई फायदे हैं, पूरी तरह से अपने लाभ को समझने की प्रक्रिया और विश्लेषणात्मक लक्षण वर्णन आवश्यक है एहसास । यह अध्ययन एक स्वचालित अतिसूक्ष्म रिएक्टर प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक दिशानिर्देश के साथ उपयोगकर्ता प्रदान करता है, कि विकसित और व्यक्तिगत अनुसंधान की जरूरत के अनुसार सुधार किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को विश्लेषणात्मक समर्थन वे प्रदान के लिए स्कॉट लुटे शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । आंशिक आंतरिक धन और इस काम के लिए समर्थन CDER महत्वपूर्ण पथ कार्यक्रम (सीए #1-13) द्वारा प्रदान किया गया था । इस परियोजना के भाग में इंटर्नशिप के लिए एक नियुक्ति द्वारा समर्थित किया गया/जैव प्रौद्योगिकी उत्पादों, अमेरिकी खाद्य और औषधि प्रशासन, ओक रिज विज्ञान और शिक्षा के लिए एक के माध्यम से संस्थान द्वारा प्रशासित के कार्यालय में अनुसंधान भागीदारी कार्यक्रम ऊर्जा और एफडीए के अमेरिकी विभाग के बीच समझौता एजेंसी ।
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |