توليد هومو-وهيتيروجرافتس بين البطيخ والقرع زجاجة لدراسة MicroRNAs المراعية للبرد
Summary
نقدم هنا بروتوكولا مفصلاً لكفاءة صنع إنسان-وهيتيروجرافتس بين البطيخ والقرع زجاجة، بالإضافة إلى أساليب أخذ عينات الأنسجة وتوليد البيانات، وتحليل البيانات، لتحقيق ميكرورناس الباردة المراعية.
Abstract
ميكرورناس (ميرناس) الذاتية الصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 20-24 nt، المعروف أن تلعب أدواراً هامة في تنمية النباتات والتكيف. وهناك تراكم أدلة تبين أن تتغير تعابير معينة ميرناس عند التطعيم، ممارسات زراعية التي يستعملها المزارعون عادة إلى تحسين المحاصيل التسامح الإجهادات الحيوية واللاحيويه. زجاجة قرع المحصول أصلاً قادرة على مواجهة مناخ مقارنة بكثير من الأخرى والقرعيات الرئيسية، بما في ذلك البطيخ، وجعلها واحدة من أصول الأكثر استخداماً لهذا الأخير. النهوض بالتكنولوجيات التسلسل الفائق مؤخرا أتاح فرصاً كبيرة للتحقيق في ميرناس المراعية للبرد ومساهماتها في مزايا هيتيروجرافت؛ ومع ذلك، إجراءات تجريبية كافية شرطا مسبقاً لهذا الغرض. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لكفاءة توليد هومو-وهيتيروجرافتس بين البطيخ الباردة عرضه وزجاجة قرع البرد، بالإضافة إلى أساليب أخذ عينات الأنسجة وتوليد البيانات، وتحليل البيانات. الأساليب المقدمة مفيدة أيضا لأنظمة أخرى تطعيم النبات، باستجواب ميرنا الأنظمة تحت الضغوط البيئية المختلفة، مثل الحرارة والجفاف والملوحة.
Introduction
تطعيم طالما استخدمت كأسلوب زراعية لتحسين إنتاج المحاصيل والتسامح لتؤكد الحيوية وغير الحيوية1،،من23. في أنظمة هيتيروجرافتينج، أصول النخبة يمكن تعزيز امتصاص المياه والمواد الغذائية من النباتات وتعزيز المقاومة للعوامل الممرضة في التربة والحد من الآثار السلبية لسمية المعادن4،5، مما قد يضفي الطعوم معزز قوة النمو وزيادة تحمل الإجهاد البيئي. في كثير من الحالات، يمكن أيضا أن تؤثر هيتيروجرافتينج صفات الفاكهة في النباتات البستانية، مما يؤدي إلى نكهة الفاكهة المحسنة، وزيادة المحتوى من المركبات ذات الصلة بالصحة6،7. فقد وجد أن نقل المسافات الطويلة فيتوهورمونيس والكشف، الببتيدات والبروتينات بين أصول وسليل إليه أساسية لتحوير في النمو والتنمية إعادة برمجة سليل النباتات8،9 ،10. التطعيم قد استخدمت على نطاق واسع في الدراسات يشير إلى مسافات بعيدة والنقل فيما يتعلق بالتكيف البيئي11. تجارب التطعيم قوية خاصة للكشف عن الجزيئات المنقولة في تلقي الأنسجة أو ساب الأوعية الدموية، وتنشيط أو قمع الأهداف الجزيئية بسبب إشارة الإرسال12لا لبس فيها.
ترميز عدم الكشف، فئة كبيرة من الجيش الملكي النيبالي أن تمارس وظائفها التنظيمية الهامة في الخلايا، وأفيد أن تلعب دوراً في تسهيل تكيف النبات للإجهاد اللاأحيائية13. ميرناس الذاتية الصغيرة غير الترميز الكشف من حوالي 20-24 nt. الدراسات كشفت عن الدور التنظيمي ميرناس في مختلف جوانب أنشطة المصنع، مثل إطلاق النار على النمو، والوحشي جذر تشكيل14،،من1516، امتصاص المغذيات، والايض كبريتات والتوازن17، والردود على الحيوية وغير الحيوية التأكيد على18. في الآونة الأخيرة، تتعلق بالتعبير عن ميرناس وجيناتها الهدف الملح التسامح الإجهاد في شتلات خيار هيتيروجرافتيد19. في ترقيع إينتيرفاريتي من العنب، وجد أن تعتمد على النمط الوراثي20ردود التعبير ميرنا لإجهاد الجفاف.
التطور السريع، وانخفاض تكلفة تكنولوجيا التسلسل الفائق وفرت فرصة كبيرة لدراسة الأنظمة ميرنا في النباتات الخواص. بطيخ (سيترولوس صوفي [ثونب]. Mansf.)، ومحصولا هاما كوكوربيت نمت في جميع أنحاء العالم، وهو عرضه لدرجات الحرارة المنخفضة. زجاجة قرع (قرع التزيين [مولينا] (ستاندل.) كوكوربيت أكثر مرونة في مناخ يشيع استخدام المزارعين ل graft مع البطيخ. أن الهدف الأساسي للدراسة الحالية وضع معيار، تتسم بالكفاءة، وأسلوب مناسب لصنع هيتيروجرافتس بين البطيخ (سيترولوس صوفي [ثونب]. منصف). وزجاجة قرع (ستاندلقرع التزيين [مولينا]). كما يوفر هذا البروتوكول مخطط تجريبي تفصيلية والإجراءات التحليلية لدراسة تنظيم التعبيرات ميرنا بعد التطعيم، التي مفيدة للكشف عن الآليات الكامنة وراء مزايا هيتيروجرافتينج.
وتشمل المواد النباتية المستخدمة في هذه الدراسة الصنف البطيخ و landrace زجاجة قرع. هو البطيخ الأصناف المستنبطة الصنف تجاري مع عالية الغلة لكن عرضه لدرجات الحرارة المنخفضة. زجاجة قرع landrace أصول شعبية للتطعيم بالبطيخ، والخيار، وزجاجة قرع، سبب عن التسامح ممتازة لانخفاض درجات الحرارة21.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، وصفت لنا بالتفصيل طريقة عالية الكفاءة واستنساخه لجعل إنسان-وهيتيروجرافتس بين البطيخ والقرع زجاجة. من السهل جداً أن تعمل هذا الأسلوب، يتطلب أي معدات خاصة، وعادة بمعدل بقاء عالية جداً للتطعيم. يمكن أيضا استخدام الأسلوب جعل الطعوم لغيرها والقرعيات، كما هو الحال بين البطي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31772191) ومشروع البحث للمصلحة العامة في مقاطعة تشجيانغ (32027 ج 2017)، مفتاح العلم مشروع لتربية النباتات في تشجيانغ (2016 ج 02051) والبرنامج الوطني الدعم للمهنيين الشباب أرفع (المقصف).
Materials
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| RNA-free DNase I | Takara | D2270A | |
| Truseq Small RNA sample prep Kit | Illumina | RS-200-0012 | |
| 2100 Bionalyser | Agilent | 5067 | |
| DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| UEA sRNA workbench 2.4-plant version (software) | NA | NA | http://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/ |
| Rfam 11.0 database (website) | NA | NA | http://rfam.janelia.org |
| miRBase 22.0 (website) | NA | NA | http://www.mirbase.org/ |
| MIREAP(software) | NA | NA | https://sourceforge.net/projects/mireap/ |
| TargetFinder (software) | NA | NA | http://targetfinder.org/ |
References
- Schwarz, D., Rouphael, Y., Colla, G., Venema, J. H. Grafting as a tool to improve tolerance of vegetables to abiotic stresses: Thermal stress, water stress and organic pollutants. Scientia Horticulturae. 127, 162-171 (2010).
- Li, Y., et al. Mechanisms of tolerance differences in cucumber seedlings grafted on rootstocks with different tolerance to low temperature and weak light stresses. Turkish Journal of Botany. 39 (4), 606-614 (2015).
- Li, C. H., Li, Y. S., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. Dynamic Expression of miRNAs and Their Targets in the Response to Drought Stress of Grafted Cucumber Seedlings. Horticultural Plant Journal. 2 (1), 41-49 (2016).
- Rouphael, Y., Cardarelli, M., Colla, G., Rea, E. Yield, mineral composition, water relations, and water use efficiency of grafted mini-watermelon plants under deficit irrigation. HortScience. 43 (3), 730-736 (2008).
- Savvas, D., et al. Interactive effects of grafting and manganese supply on growth, yield, and nutrient uptake by tomato. HortScience. 44 (7), 1978-1982 (2009).
- Aloni, B., Cohen, R., Karni, L., Aktas, H., Edelstein, M. Hormonal signaling in rootstock-scion interactions. Scientia Horticulturae. 127, 119-126 (2010).
- Rouphael, Y., Caradrelli, M., Rea, E., Colla, G. Improving melon and cucumber photosynthetic activity, mineral composition, and growth performance under salinity stress by grafting onto Cucurbita hybrid rootstocks. Photosynthetica. 50 (2), 180-188 (2012).
- Louws, F. J., Rivard, C. L., Kubota, C. Grafting fruiting vegetables to manage soilborne pathogens, foliar pathogens, arthropods and weeds. Scientia Horticulturae. 127 (2), 127-146 (2010).
- Asins, M. J., et al. Genetic analysis of rootstock-mediated nitrogen (N) uptake and root-to-shoot signalling at contrasting N availabilities in tomato. Plant Science. 263, 94-106 (2017).
- Yin, L. K., et al. Role of protective enzymes in tomato rootstocks to resist root knot nematodes. Acta Horticulturae. 1086 (1086), 213-218 (2015).
- Gaion, L. A., Carvalho, R. F. Long-Distance Signaling: what grafting has revealed?. Journal of Plant Growth Regulation. 37 (2), 694-704 (2018).
- Turnbull, C. G., Hennig, L., Köhler, C. Grafting as a research tool. Plant Developmental Biology. , 11-26 (2010).
- Li, C., et al. Grafting-responsive miRNAs in cucumber and pumpkin seedlings identified by high-throughput sequencing at whole genome level. Physiologia Plantarum. 151 (4), 406-422 (2014).
- Lakhotia, N., et al. Identification and characterization of miRNAome in root, stem, leaf and tuber developmental stages of potato (Solanum tuberosum L.) by high-throughput sequencing. BMC Plant Biology. 14 (1), 6 (2014).
- Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Bartel, B. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 19-53 (2006).
- Puzey, J. R., Kramer, E. M. Identification of conserved Aquilegia coerulea microRNAs and their targets. Genetic. 448 (1), 46-56 (2009).
- Matthewman, C. A., et al. miR395 is a general component of the sulfate assimilation regulatory network in Arabidopsis. FEBS Letters. 586 (19), 3242-3248 (2012).
- Ali, E. M., et al. Transmission of RNA silencing signal through grafting confers virus resistance from transgenically silenced tobacco rootstocks to non-transgenic tomato and tobacco scions. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 25 (3), 245-252 (2016).
- Li, Y. S., Li, C. H., Bai, L. Q., He, C. X., Yu, X. C. MicroRNA and target gene responses to salt stress in grafted cucumber seedlings. Acta Physiologiae Plantarum. 38 (2), 1-12 (2016).
- Pagliarani, C., et al. The accumulation of miRNAs differentially modulated by drought stress is affected by grafting in grapevine. Plant Physiology. 173 (4), 2180-2195 (2017).
- Liu, N., Yang, J. H., Guo, S. G., Xu, Y., Zhang, M. F. Genome-wide identification and comparative analysis of conserved and novel microRNAs in grafted watermelon by high-throughput sequencing. PLoS One. 8 (2), e57359 (2013).
- Song, G. Development of 2JC-350 automatic grafting machine with cut grafting method for vegetable seedling. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering. 22 (12), 103-106 (2006).
- Kumar, D., et al. Uncovering leaf rust responsive miRNAs in wheat (triticum aestivum l.) using high-throughput sequencing and prediction of their targets through degradome analysis. Planta. 245 (1), 1-22 (2016).
- Kohli, D., et al. Identification and characterization of wilt and salt stress-responsive microRNAs in chickpea through high-throughput sequencing. PLoS One. 9 (10), e108851 (2014).
- Salzberg, S. L. Computational challenges in next-generation genomics. International Conference on Scientific and Statistical Database Management. ACM. 2, (2013).
- Guo, S. G., et al. The draft genome of watermelon (Citrullus lanatus) and resequencing of 20 diverse accessions. Nature Genetics. 45, 51-58 (2013).
- Wang, Y., et al. Gourdbase: a genome-centered multi-omics database for the bottle gourd (lagenaria siceraria), an economically important cucurbit crop. Scientific Reports. 8 (1), 306 (2018).
- Wang, X. F., Liu, X. S. Systematic Curation of miRBase Annotation Using Integrated Small RNA High-Throughput Sequencing Data for C. elegans and Drosophila. Frontiers in Genetics. 2, 25 (2011).
- Bo, X. C., Wang, S. Q. TargetFinder: a software for antisense oligonucleotide target site selection based on MAST and secondary structures of target mRNA. Bioinformatics. 21 (8), 1401-1402 (2005).
- . GOATOOLS: Tools for Gene Ontology Available from: https://doi.org/10.5281/zenodo.31628 (2015)
- Wang, L. P., Li, G. J., Wu, X. H., Xu, P. Comparative proteomic analyses provide novel insights into the effects of grafting wound and hetero-grafting per se on bottle gourd. Scientia Horticulturae. 200 (8), 1-6 (2016).
