Une méthode axée sur le moule Net de la création de tissu cardiaque exempte d’échafaudage tridimensionnel

Résumé

Ce protocole décrit une méthode axée sur le moule nette pour créer des tissus cardiaques exempte d’échafaudage tridimensionnels avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone.

Résumé

Ce protocole décrit un procédé nouveau et facile net axée sur le moule pour créer des tissus cardiaques d’en trois dimensions (3d) sans matériel d’échafaudage supplémentaires. Cardiomyocytes de DERIVES de cellules-souches humaines pluripotentes (iPSC-CMs), les fibroblastes cardiaques humaines (CS) et les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont isolées et utilisés pour générer une suspension de cellules avec 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs. Ils sont conjointement mis en culture dans un système de « goutte suspendue » de fixation ultra faible, qui contient des micropores de condensation des centaines des sphéroïdes à un moment donné. Les cellules agrègent et forment spontanément sphéroïdes de battement après 3 jours de culture mixte. Les sphéroïdes sont récoltés, ensemencées dans une cavité de moule roman et cultivées sur un agitateur dans l’incubateur. Les sphéroïdes devient un tissu fonctionnel mature environ 7 jours après le semis. Les tissus multicouches qui en résulte se composent des sphéroïdes fusionnés avec intégrité structurale satisfaisante et le comportement de battement synchrone. Cette nouvelle méthode a un potentiel prometteur comme une méthode reproductible et rentable de créer des tissus conçus pour le traitement de l’insuffisance cardiaque à l’avenir.

Introduction

Ingénierie de tissu cardiaque actuelle vise à développer une thérapie pour remplacer ou réparer la structure et la fonction du tissu myocardique lésée¹. Méthodes pour créer des modèles 3D de tissu cardiaque présentant les propriétés contractiles et électrophysiologiques importantes du tissu cardiaque indigène ont rapidement étendu^2,3. Diverses stratégies ont été exploré et utilisé dans les études^4,5. Ces méthodes vont de l’utilisation des hydrogels bioactifs naturels et synthétiques spécifiques, comme la gélatine, le collagène, ....

Protocole

1. préparation des Cardiomyocytes

1. Plaques 6 puits manteau avec membrane basale matrice et la culture anthropique des cellules souches pluripotentes (hiPSCs) comme décrit plus haut¹⁷.
2. La différence de hiPSCs en hiPSC-CMs à l’aide des méthodes décrites précédemment,¹⁸.
3. À différenciation après d 16-18, suspendre les cardiomyocytes en rinçant chaque puits avec 2 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ou magnésium, suivi par incubation avec 1 mL/puits de la trypsine ou cellule réactif de dissociation (voir Table de Matériaux) pendant 5 min à températu....

Résultats

Dans nos expériences, nous avons utilisé une suspension cellulaire de 70 % iPSC-CMs, CS de 15 % et 15 % HUVECs en milieux cellulaires RPMI/B-27 à une concentration de 2 475 000 cellules / mL. Après avoir créé la suspension cellulaire, nous avons distribué 4 mL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’un accessoire ultra faible chute de système, comme indiqué au point 4.3 du protocole. L’utilisation de la pendaison goutte système conduit à la formation spontanée de centaines de batt.......

Discussion

L’importance de cette méthode réside dans sa reproductibilité et l’efficacité du tissu cardiaque multicouche qui en résulte. Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cardiaque, l’un des objectifs actuels est d’identifier une méthode pour construire les patchs cardiaques 3D battant, multicouches et fonctionnelles. Nous rapportons une méthode efficace et reproductible de création de plusieurs couches de tissus cardiaques par semis manuel direct des sphéroïdes composés des cardiomyocytes, cellules endothéliales, fibroblas.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fibroblastes cardiaques humains (HCF)	Sciencell	6310
FM-2 Se compose d’un milieu basal	Sciencell	2331	HCF
Cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)	Lonza	CC-2935
EGM+Bullet Kit  ;	Lonza	CC5035	Milieu de culture HUVEC
E8 media  ;	Invitrogen	A1517001	HiPSC
Geltrex  ;	Invitrogen	A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher	12604013	Trypsine et réactif de dissociation cellulaire
Milieu RPMI	Invitrogen	11875093	avec supplément B-27 est un milieu de culture hiPSC-CM
Supplément B-27 (50x)	Le milieu Thermo Fisher 17504044		RPMI avec supplément B-27 est un milieu de culture hiPSC-CM
Trypan Blue Solution, 0,4 %	Thermo Fisher	15250061
Novel moule à filet	TissueByNet Co.,Ltd	NM25-1
Plaque de chute suspendue	Kuraray Co.,Ltd	MPc350
6 plaques de puits  ;	Sigma-Aldrich	CLS-3516

Milieu de culture