Här presenterar vi ett protokoll för användning av befintlig antibiotika resistens-kassett radering konstruktioner som underlag för att göra strykningen mutanter i andra E. coli -stammar. Sådan radering mutationer kan mobiliseras och infogas i det motsvarande locus av en mottagare stam med P1 bacteriophage transduktion.
En första metod att studera funktionen av en okänd gen hos bakterier är att skapa en knock-out av denna gen. Här beskriver vi en robust och snabb protokoll för att överföra genmutationer borttagning från en Escherichia coli stam till en annan med hjälp av generaliserad transduktion med bacteriophage P1. Denna metod kräver att mutationen kan väljas (t.ex. baserat på genen störningar med antibiotika kassett infogningar). Sådana antibiotika kassetter kan mobiliseras från en donator stam och införas till en mottagare stam av intresse för snabbt och generera enkelt en gen radering mutant. Antibiotikum kassetten kan utformas att inkludera flippase erkännande webbplatser som tillåter excision av kassetten genom en platsspecifik recombinase att producera en ren knock-out med endast en ~ 100-base-par-långa ärr sekvens i genomet. Vi visar protokollet genom att slå ut den tamA -gen som kodar en församling faktor inblandad i autotransporter biogenes och testa effekten av denna knock-out på biogenes och funktion av två trimeric autotransporter adhesiner. Även gen radering av P1 transduktion har sina begränsningar, gör den lätthet och snabbhet av dess genomförande det ett attraktivt alternativ till andra metoder för genterapi radering.
En vanlig första metod att studera funktionen av en gen är att utföra knock-out mutagenes och observera den resulterande fenotypen. Detta kallas också omvänd genetik. Bakterien E. coli har varit arbetshästen i molekylärbiologi för de senaste 70 åren eller så, på grund av förenklar dess odling och dess föredragandens genmanipulation1. Flera metoder har utvecklats för att producera gen borttagningar i E. coli, inklusive markör exchange mutagenes2,3 och, mer nyligen, recombineering använder den λ röd eller Rac ET system4,5 , 6.
I ett allmänt använt system ersättas kodande sekvenser av enskilda gener med en antibiotikaresistens kassett som senare kan vara censurerade från kromosom5,7. De kodande sekvenserna byts ut, till exempel genom en kanamycin (Kan) motstånd kassett, som flankeras av flippase (FLP) erkännande mål (FRT) platser på vardera sidan. FRT platserna identifieras av recombinase FLP, som medlar platsspecifika rekombination mellan FRT platser leder till borttagningen av Kan kassett. På detta sätt kan en fullständig radering av en given genens kodande sekvens uppnås, lämnar efter sig endast en minimal ärr sekvens av ungefärligt 100 baspar (bp) (figur 1).
Drygt ett decennium sedan utvecklades den så kallade Keio-samlingen. Detta är en bakteriell bibliotek baserat på en standard laboratorium E. coli K12 stammen, där nästan alla icke-väsentliga gener ströks individuellt genom λ röd rekombination7,8. Klonerna inom denna samling varje har en kodande sekvens ersatts med en punktskattepliktiga Kan motstånd kassett. Keio samlingen har visat sig vara ett användbart verktyg för många applikationer9. En sådan ansökan är produktionen av radering mutanter i andra E. coli -stammar. Kan kassetten från en given radering klon kan mobiliseras av allmänt transducing bakteriofager, såsom P110,11,12,13,14. En fag lager beredd från sådan en stam kan sedan användas till infektera en mottagare E. coli stam av intresse, där en låg men pålitlig frekvens Kan kassett-innehållande regionen kan införlivas i mottagarens genomet av homolog rekombination (Figur 2). Transductants kan väljas för tillväxten på Kan-med mediet. Efter detta, om avlägsnandet av antibiotikaresistens kassetten önskas, kan den FLP recombinase levereras till transductant stam i trans. Efter härdning av FLP-innehållande plasmid, som bär en ampicillin (Amp) motstånd markör, Kan och Amp-känsliga kloner screenas för, och den rätta excision av vildtyp kodande sekvens och kassetten Kan verifieras av kolonin PCR.
Här presenteras ett detaljerat protokoll, som beskriver varje steg i att producera en knock-out E. coli stam baserat på den strategi som beskrivs ovan. Som ett exempel demonstreras en borttagning av tamA genen. tamA kodar en yttre membranprotein i β-fat, som är en del av Transport och montering modul (TAM), som är involverat i biogenes av vissa autotransporter proteiner och pili15,16,17. Denna knock-out stam användes sedan för att undersöka effekten av tamA borttagningen på biogenes av två trimeric autotransporter adhesiner (TAAs), den Yersinia adhesin YadA och den E. coli immunglobulin (Ig)-bindande TAA EibD 18,19.
P1 transduktion är en snabb, robust och tillförlitlig metod för att generera gen borttagningar i E. coli. Detta framgår här av transducing en tamA radering mutant från en Keio givare stam till en BL21-derived mottagare. De stora stegen i signaltransduktion processen är produktionen av den transducing lysate, transduktion själv, excision av Kan motstånd kassetten och kontrollen av den knock-out med PCR. Totalt, processen tar cirka 1 vecka och kräver ingen molekylärbiologiska metoder användas,…
The authors have nothing to disclose.
Keio samling stammar erhölls från det nationella BioResource-projektet (NIG, Japan): E. coli. Vi tackar Dirk Linke (Institutionen för biovetenskaper, universitetet i Oslo) för hans fortsatta stöd. Detta arbete finansierades av Vetenskapsrådet Norge ung forskare bidrag 249793 (till Jack C. Leo).
Strains | |||
E. coli BW25113 | NIG | ME6092 | Wild-type strain of Keio collection |
E. coli BL21(DE3) | Merck | 69450-3 | Expression strain |
E. coli BL21DABCF | Addgene | 102270 | Derived from BL21(DE3) |
E. coli JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA deletion mutant |
P1 vir | NIG | HR16 | Generally transducing bacteriophage |
Plasmids | |||
pCP20 | CGSC | 14177 | conditionally replicating plasmid with FLP |
pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | expression vector |
pEibD10 | N/A | N/A | for production of EibD; plasmid available on request |
pET22b+ | Merck | 69744-3 | expression vector |
pIBA2-YadA | N/A | N/A | for production of YadA; plasmid available on request |
Chemicals | |||
Acetic acid | ThermoFisher | 33209 | |
Agar | BD Bacto | 214010 | |
Agarose | Lonza | 50004 | |
Ampicillin | Applichem | A0839 | |
Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
anti-collagen type I antibody COL-1 | Sigma | C2456 | |
Bovine collagen type I | Sigma | C9791 | |
Calcium chloride | Merck | 102382 | |
Chloroform | Merck | 102445 | |
Di-sodium hydrogen phosphate | VWR | 28029 | |
DNA dye | Thermo | S33102 | |
DNA molecular size marker | New England BioLabs | N3232S | |
DNase I | Sigma | DN25 | |
dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
ECL HRP substrate | Advansta | K-12045 | |
EDTA | Applichem | A2937 | |
Glycerol | VWR | 24388 | |
goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
goat anti-rabbit IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
HEPES | VWR | 30487 | |
Isopropyl thiogalactoside | VWR | 43714 | |
Kanamycin | Applichem | A1493 | |
Lysozyme | Applichem | A4972 | |
Magnesium chloride | VWR | 25108 | |
Manganese chloride | Sigma | 221279 | |
N-lauroyl sarcosine | Sigma | L9150 | |
Skim milk powder | Sigma | 70166 | |
Sodium chloride | VWR | 27808 | |
tamA forward primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-GAAAAAAGGATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
tamA reverse primer | Invitrogen | N/A | Sequence 5'-TCATAATTCTGGCCCCAGACC-3' |
Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
Tri-sodium citrate | Merck | 106448 | |
Tryptone | VWR | 84610 | |
Tween20 | Sigma | P1379 | |
Yeast extract | Merck | 103753 | |
Equipment | |||
Agarose gel electrophoresis chamber | Hoefer | SUB13 | |
Bead beater | Thermo | FP120A-115 | |
CCD camera | Kodak | 4000R | |
Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
Electroporation unit | Bio-Rad | 1652100 | |
Gel imager | Nippon Genetics | GP-03LED | |
Incubating shaker | Infors HT | Minitron | |
Incubator | VWR | 390-0482 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
Microwave oven | Samsung | CM1099A | |
PCR machine | Biometra | Tpersonal | |
PCR strips | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
pH meter | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
PVDF membrane | ThermoFisher | 88518 | |
SDS-PAG electrophoresis chamber | ThermoFisher | A25977 | |
Tabletop centrifuge | Beckman Coulter | B06322 | |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Water bath | GFL | D3006 | |
Wet transfer unit | Hoefer | TE22 |