Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

Sommario

Qui, presentiamo i protocolli per l'utilizzazione del insetto cella e baculovirus proteina espressione sistema per produrre grandi quantità di proteine vegetali secernuta per cristallizzazione della proteina. Un vettore di espressione di baculovirus è stato modificato con GP67 o insetto hemolin peptide di segnale per espressione di secrezione della proteina vegetale in cellule di insetto.

Abstract

È stata una sfida per gli scienziati di esprimere proteine eucariotiche secretive ricombinanti per studi strutturali e biochimiche. Il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto è uno dei sistemi utilizzati per esprimere proteine secretorie eucariotiche ricombinante con alcune modificazioni post-traduzionali. Le proteine secretorie devono essere instradati attraverso le vie secretive per glicosilazione della proteina, la formazione di legami disolfuro e altre modificazioni post-traduzionali. Per migliorare l'espressione delle cellule dell'insetto esistente di proteine secretorie vegetali, un vettore di espressione di baculovirus viene modificato con l'aggiunta di sia un GP67 o una sequenza del peptide segnale hemolin tra il promotore e il multiplo-clonazione siti. Questo sistema di nuova concezione modificate vettoriale prodotto con successo una resa elevata di proteine recettori solubili ricombinante pianta secreta di Arabidopsis thaliana. Due delle proteine espresse pianta, domini extracellulari dei recettori di membrana plasmatica di Arabidopsis TDR e PRK3, sono state cristallizzate per studi cristallografici dei raggi x. Il sistema vector modificate è un strumento migliorato che potenzialmente può essere utilizzato per l'espressione di proteine ricombinanti secretive nel Regno animale pure.

Introduzione

È indispensabile per un laboratorio di ricerca essere in grado di produrre grandi quantità di proteine ricombinanti omogenei per le caratterizzazioni biochimiche e biofisiche, soprattutto per studi cristallografici dei raggi x. Ci sono molti sistemi di espressione eterologa affermati quali Escherichia coli, lieviti, cellule di insetto, cellule di mammifero, cellule vegetali, ecc tra loro, il sistema di espressione di baculovirus-mediata delle cellule di insetto è uno dei più comunemente utilizzato tecniche per produrre grandi quantità di proteine eucariotiche ricombinanti grandi strutturalmente piegate per proteina cristallizzazione^....

Protocollo

Nota: Viene utilizzato un sistema di insetto cella/baculovirus con vettori di espressione modificate per l'espressione della proteina secretoria pianta e cristallizzazione.

1. modifica di un vettore di espressione di Baculovirus con il Peptide di segnale GP67 per espressione di secrezione della proteina vegetale

1. Sintetizzare un frammento di DNA contenente un 5' BglII taglio sito¹³, la sequenza di segnale di secrezione GP67 e un sito multi-clonazione con NotI, BamHI, EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI e XhoI (Figura 1A).
   Nota: Poiché sia BglII e BamHI digerito DNA ha provoca....

Risultati

Come illustrato nella Figura 1, due vettori di espressione del baculovirus pFastBac1 modificate sono stati utilizzati per esprimere le proteine secrete con la GP67 o la sequenza segnale hemolin per sostituire la sequenza segnale intrinseco del gene target. il GP67 virale ed i geni di hemolin dell'insetto sono stati dimostrati per avere i livelli di espressione di alta secrezione nelle cellule. Proteine di fusione con uno di questi due sequenze di segnale si p.......

Discussione

L'eterogeneità nella dimensione e nella stabilità delle migliaia di proteine presenti nei sistemi biologici, è spesso empirico per una ricerca di laboratorio per decidere quale sistema di espressione eterologa deve essere scelto per l'espressione di una proteina specifica. Il sistema di espressione di e. coli è spesso la prima scelta per l'espressione della proteina a causa del breve ciclo di vita dei batteri, basso costi dei terreni di coltura e relativa facilità di scalare fino¹⁹. Per l.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agitatore per incubatrice	VWR	Modello Excella E25	27 oC
Incubatrice	VWR	Modello 2005	27 oC
Centrifuga	BECKMAN	Modello J-6	con rotore a secchiello oscillante
Herculase II Fusion DNA Polymerase	Agilent	600677-51	Per l'amplificazione PCR del DNA
Thermal Cycler	BIO-RAD	Modello C1000 Touch	Per l'amplificazione PCR dell'agitatore per
incubatore	New Brunswick Modello scientifico	I 24	Per la coltivazione della coltura di baceria
Sintesi del DNA del cliente	GENSCRIPT
BamHI (HF)	New England Biolabs	R3136S	Endonucleasi di restrizione
BglII	New England Biolabs	R0144S	Endonucleasi di restrizione
NotI (HF)	New England Biolabs	R3189S	Restrizione Endonucleasi
XhoI	New England Biolabs	R0146S	Restrizione Endonucleasi
T4 DNA ligasi	New England Biolabs	M0202T	Legatura del DNA
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	Purificazione del DNA dal gel di agorasa
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Purificazione del DNA plasmidico da coltura batterica
Agarosio	Thermo Fisher Scientific	15510-019	Per l'elettroferosi su gel di DNA
MAX Efficienza DH5α cellula competente	Invitrogen	18-258-012	Per la trasformazione della miscela di legatura del DNA
Lennox L LB Broth	Research Product International Corp.	L24066-5000.0	Per la produzione di colture batteriche
Ampicillina sale sodico	Thermo Fisher Scientific	11593-019	Antibiotici
Kanamicina Solfato	Thermo Fisher Scientific	15160-054	Antibiotici
Tetraciclina	Thermo Fisher Scientific	64-75-5	Antibiotici
Gentamicina	Thermo Fisher Scientific	15710-064	Antibiotici
MAX Efficiency DH10Bac cellule competenti	Thermo Fisher Scientific	10361-012	Per la produzione di bacmid DNA
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544-034	Per la trasformazione del DNA
Reagente CellFECTIN II Thermo	Fisher Scientific	10362-101	Reagente per trasfezione di cellule di insetti
Sistema di espressione Bac-to-Bac	Thermo Fisher Scientific	10359-016	Kit di espressione di cellule di baculovirus-insetti
Bluo-gal	Thermo Fisher Scientific	15519-028	Per l'isolamento del contenente Bacmid DNA
IPTG	Thermo Fisher Scientific	15529-019	Per l'isolamento del recominante Bacmid DNA
pFastBac1	Thermo Fisher Scientific	10360014	Vettore di espressione di Baculorirus
Sf9 cellule	Thermo Fisher Scientific	11496015	Celle monostrato Sf9
Celle Hi5	Thermo Fisher Scientific	B85502	High Five celle per insetti
Grace' s insetto medium, non integrato	Thermo Fisher Scientific	11595030	Sf9 trasfezione cellulare minimo
medium Grace' s terreno per insetti, integrato	Thermo Fisher Scientific	11605102	Sf9 terreno completo per colture cellulari monostrato
Sf-900 II SFM	Thermo Fisher Scientific	10902104	Sf9 terreno per coltura cellulare in sospensione senza FBS
Express Five SFM Thermo	Fisher Scientific	10486025	terreno per colture cellulari Hi5
Penicillina-Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 ml (10.000 U.I./ml)
L-glutammina (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	100 ml
Certificato FBS Thermo	Fisher Scientific	16000-044	500 ml
Piastre a 6 pozzetti	Thermo Fisher Scientific 08-772-1B		Piastre a fondo piatto
150 mm	Thermo Fisher Scientific	353025	100/confezione
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	USA Scientific	1415-2500	500 provette/sacchetto
15 ml con tappo a vite conico provette da centrifuga	USA Scientific	1475-0511	25 provette/sacchetto
50 ml con tappo a vite conico provette da centrifuga	USA Scientific	1500-1211	25 provette/sacchetto
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430	NiNTA resina
strisce indicatrici di pH	EMD Millipore Corporation	1.09535.0001	pH 0 - 14

di DNA da