Spontant kontrahering syncytia av cardiomyocytes fra menneskeskapte pluripotent er stamceller nyttige modeller av menneskelige hjerte fysiologi og farmakologi. Her presenterer vi en høy gjennomstrømming screening system for å kvantifisere effekten av eksogene forbindelser på slo frekvens, en Ca-sensitive fluorescerende farge og en temperaturkontrollert tenkelig flere godt plate leser.
Spontant kontrahering syncytia av cardiomyocytes fra menneskeskapte pluripotent er stamceller (hiPSC CM) en nyttig modell av menneskelige hjerte fysiologi og farmakologi. Ulike metoder er foreslått å registrere denne spontan aktivitet og evaluere narkotika effekter, men mange av disse metodene lider av begrenset produksjon og/eller fysiologiske relevans. Vi utviklet en høy gjennomstrømming screening system for å kvantifisere effekten av eksogene forbindelser på hiPSC-CM juling frekvens, bruke en Ca-sensitive fluorescerende farge og en temperaturkontrollert tenkelig flere godt plate leser. Beskriver vi hvordan å forberede de cellen og de sammensatte platene og hvordan du kjører automatisert analysen for å oppnå høy følsomhet og reproduserbarhet. Vi beskriver hvordan å transformere og analysere fluorescens data gir pålitelig tiltak narkotika effekter på spontan rytme. Denne analysen kan brukes i stoffet funnet programmer for å veilede kjemiske optimalisering bort fra eller mot, forbindelser påvirker menneskelig hjertefunksjon.
Nåværende protokollen viser en metode for å måle narkotika effekter på spontan vibrerende frekvensen av syncytia hiPSC-cm på fysiologisk relevante rytmer. Menneskeskapte pluripotent stamceller kan skille ut funksjonelle cardiomyocytes oppretter spontant slo syncytia i vitro1,2,3,4. Disse hiPSC CM kan fås i stort antall gjennom kommersielle leverandører eller gjennom produksjon i laboratoriet, og de er en nyttig kilde av celler til å generere modeller for menneskelig hjerte fysiologi og farmakologi. Spesielt kan de brukes til å forutsi eller å karakterisere kardial effekter som kan oppstå når et stoff administreres til mennesker5.
Vibrerende frekvensen av hiPSC CM syncytia kan måles under fysiologiske forhold microelectrode matriser eller impedans sensing1: disse noninvasive teknikker gir svært detaljert informasjon om virkninger av rusmidler, men de er ganske lav gjennomstrømming og de aktiverer ikke testing store sammensatte biblioteker i realistisk tid og budsjettbegrensninger. Et mer effektivt system kan utdypes bruker en 384-vel fluorescens imaging plate leseren og en Ca-følsom fargestoff6, men klassisk plate lesere er hindret av suboptimal temperatur kontroll og oppkjøp frekvens. Disse begrensningene er illustrert av unphysiological juling priser (~ 15 bpm, sammenlignet med 35-55 bpm i kontrollerte miljøer1) og dårlig Ca signal oppløsning (en oppkjøpet 8 Hz er på lower limit til posten priser som kan nå 120 bpm under stimulert forhold, og det kan ikke trekke ut informasjon som skråningen eller varighet). Metoden beskrevet her kombinerer innspillingen av slo mønstre fysiologiske rytmer og tilstrekkelig oppløsning til å utelukke disse bekymringene.
På den positive siden er denne metoden enkel, pålitelig og høy gjennomstrømning, som tillater rask testing av store antall forbindelser til rimelige kostnader. På den negative siden, denne metoden krever en rask plate leser med effektiv temperaturkontroll, som er en kostbar investering, og det gir litt mekanistisk informasjon om observerte narkotika effekter, som kan nødvendiggjøre ytterligere testing med mer detaljerte metoder.
Approximatively 6 x 106 hiPSC CM er nødvendig for en måling i en 384-vel celle plate. hiPSC-CM leveres vanligvis kommersielt som frosne dele ~ 4 x 106 celler i 1 mL. Derfor er det praktisk å forberede to cellen plater med tre frosne dele. I de fleste tilfeller, på grunn av lav variasjon av denne analysen, er det tilstrekkelig å utføre like målinger av testen forbindelser, og i hver celle plate, quadruplicate målinger av positiv kontrollene (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin og E-4031), og 20-Dupliser målinger av kontrollen negative (DMSO alene). Derfor kan maksimalt 352 sammensatte/konsentrasjon par evalueres med to 384-vel celle plater. Følgende protokollen vurderer slikt eksperiment med 352 test forbindelser, to cellen plater og 12 millioner celler som tre frosne dele; Det kan være lett skalert opp hvis det trengs flere datapunkter.
To aspekter er mest kritiske for vellykket opptak av slo frekvenser. Først er å være forsiktig med cellen plating og kultur. Spesielt er det viktig å prøve og unngå riper celle laget nederst i brønnene når utveksling medium. Det er akseptabelt å berøre bunnen av brønnene med Pipetter, men samme vinkel som skal brukes hver gang, og dermed produsere bare en liten ripe på cellen laget og ikke påvirker ytelsen analysen. Det andre viktige aspektet ved å få reproduserbar homogen rytmer er å gi god temperaturkontroll på 37 ° C over cellen platen for varigheten av måling. Vi kan ikke hente dette homogenitet med enheter enn plate leseren brukt her, men det kan være mulig med spesielle endringer i temperaturregulering: det ville gjøre protokollen presenteres her videre brukbare utover et enkelt merke av plate leseren. For å oppnå temperatur stabilitet for varigheten av forsøket med enheten brukes her, var det nødvendig å stoppe hver innspillingen før det endte; ellers roboten ville kaste ut målt celle platen. Dette teknisk problem forsvinne med neste versjon av tallerken reader-programmet, men det fortsatt avgjørende for nå. Hvis en celle plate overføres feilaktig utenfor plate leseren, må det lastes inn igjen så fort som mulig. Likevel vil kvaliteten på eksperimentet svekkes, fordi temperaturendringer påvirker den vibrerende rate svært raskt.
Det kan hende at enkelte andre aspekter, som ikke har blitt testet grundig, mindre viktig. For eksempel hiPSC CM produsenter anbefaler belegg cellekultur plater før såing cellene, men i denne bestemte analysen, belegg ble ikke brukt, fordi cellene følge ganske enkelt på ulike overflater, og det er svært vanskelig å riktig belegge 384-og plater. Likevel, celle plate belegg kan fremdeles tillatte eller den kanskje aften gjøre bedre analysen kvaliteten. Vi aldri testet om løsemidler enn DMSO vil være akseptabelt, men det forventes av erfaring med andre teknologier for opptak at lignende konsentrasjoner av EtOH eller MeOH vil også være tålelig. Vi vanligvis bruker hiPSC-CMs fra samme produsent, og celler fra bare én ekstra leverandør ble testet, som syntes å arbeide på en lignende måte. Likeledes har vi brukt bare et lite antall forskjellige grupper av hiPSC-CMs som ble valgt ved prechecking dem bekrefte at de oppførte seg på samme måte til den første batchen. En eller to grupper ble ansett som upassende fordi deres syncytia hadde dårlig stabilitet eller reproduserbarhet under kultur betingelser brukes her. Ellers dukket i farmakologi ligner på tvers av grupper ved testing et begrenset panel av “typisk” forbindelser (forskolin, N6-cyclopentyl-adenosin, og E-4031, samt endothelin, isoproterenol, amlodipine og ponesimod). Vi har bare brukt hiPSC CM fra friske blodgivere. Det kan være verdt å vurdere om hiPSC CM fra pasienter med hjerte sykdom vil gi forskjellige resultater, men ingen forskjell mellom sunn donorer og pasienter ble observert når du vurderer Kardiotoksisitet av tyrosine kinase hemmere 12. til slutt, vi normalt vente 22 – 28 dager i kultur taes narkotika effekter: vår erfaring med impedans opptak av de samme cellene, en stabil for langsom impedans (indikator for cellen lag stabilitet) og rask impedans (indikator for slo frekvens) er nådd etter 12–15 dager i kultur. Men besluttet vi å vente 22–28 dager, fordi dette er tiden når profilen for expression av cardiac kanaler og modning markører har stabilisert seg13. Det var ikke undersøkt om sammenlignbare resultater ville oppnås hvis cellene ble brukt tidligere eller senere.
Protokollen beskrevet bruker her en veldig enkel måling av spontane juling sats på hiPSC CM for å vurdere potensielle narkotika effekter på menneskelig hjerte elektrofysiologi. De viktigste fordelene over andre metoder er at i) det er mottakelig for en høy gjennomstrømming screening miljø, ii) det registrerer aktiviteten til cardiomyocytes og effekten av legemidler ved fysiologiske temperaturer og iii) den ikke krever elektrofysiologiske kompetanse for gjennomføring eller en vurdering av resultatene.
I en validering studie utført med mange legemidler godkjent for menneskelig bruk, viste vi at analysen reagerer på stoffer som brukes i human medisin som spådd av eksisterende kliniske data5. Fordi denne metoden vurderer alle potensielle virkninger på hjerte rytme, utfyller det den omfattende i vitro Proarrhythmic analysen (CiPA) initiativ14 som spesielt vurderer pro-arrhythmic potensial.
I fremtiden, kan denne metoden gi en videre forståelse av modus-of-action av narkotika vist å påvirke spontan vibrerende frekvensen. Det er sannsynlig at mekanistisk tilleggsinformasjon finnes i fluorescens opptakene av Ca transienter (f.eksi amplitude eller figur). Hvis fluorescens opptakene utføres på høyere oppkjøpet priser (f.eks, 30 Hz), disse parameterne er lett ut i tillegg slo rate, og det kan være interessant å relatere endringer i disse parameterne med kjent virkningene av klinisk brukt narkotika.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen takk.
FDSS7000 fluorescent plate reader | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
not a catalog item | |
FDSS7000 Fluo-3/Fluo-4/Fluo-8 fluorescence filter kit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
installed initially in the device |
|
FDSS7000 temperature control | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A10118-09 | |
FDSS7000 150-W Excitation Light Source Unit | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
C11653-11 | |
FDSS7000 pipet tips for 384-well plates | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
A8687-62 | |
Waveform Analysis Software for Cardiomyocytes | Hamamatsu Photonics (Massy, France) |
U8524-12 | optional alternative to the Igor Pro software |
Igor Pro data analysis software | Wavemetrics (Portland, Oregon, USA) |
Latest version | |
iCell-Cardiomyocytes Kit | Cellular Dynamics International (Madison, WI) | R1106 | includes cells, plating and maintenance media |
Cor.4U Cardiomyocyte Kit | Ncardia Germany (Cologne, Germany) |
Ax-B-HC02-4M | includes cells, plating and maintenance media alternative to the iCell-Cardiomyocytes |
384-well cell culture plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781091 | |
384-well compound plates | Greiner-Bio-One (Frickenhausen, Germany) | 781280 | |
FLIPR Calcium 4 Assay Kit | Molecular Devices (Sunnyvale, California) |
R8142 | |
Forskolin | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
F6886 | |
N6-cyclopentyl-adenosine | Sigma-Aldrich (Buchs, Switzerland) |
C8031 | |
E-4031 | Enzo Life Sciences (Lausen, Switzerland) |
BML-KC158 | |
Penicillin-Streptomycin solution | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15140-122 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco/ThermoFisher (Reinach, Switzerland) |
15250061 |