Vi utvecklat protokoll och designat en egen apparatur att aktivera inbäddning av millimeter-skala exemplar. Vi presenterar prov förberedelse förfaranden med betoning på inbäddning i akrylharts och polyimid slangar för att uppnå styv immobilisering och långvarig lagring av prover för förhör av vävnad arkitektur och cell morfologi av mikro-CT.
För över hundra år, har histologiska studier av vävnader varit guldmyntfoten för medicinsk diagnos eftersom histologi tillåter alla celltyper i varje vävnad skall identifieras och karakteriseras. Vårt laboratorium arbetar aktivt för att göra tekniska framsteg i röntgen mikro-datortomografi (mikro-CT) som kommer att föra diagnostiska kraften i histologi till studien av full vävnad volymer på cellulära upplösning (dvs., en röntgenbild Histo-tomography modalitet). Mot detta syfte har vi gjort riktade förbättringar till prov förberedelse rörledningen. En nyckel optimering och fokus i detta arbete, är en enkel metod för styv inbäddning av fasta och färgade millimeter-skala prover. Många av de publicerade metoderna för provet immobilisering och korrelat mikro-CT imaging förlitar sig på att placera proverna i paraffin vax, agaros eller vätskor såsom alkohol. Vår strategi sträcker sig detta arbete med anpassade förfaranden och utformningen av en 3-dimensionell utskrivbara apparater till bädda in proverna i en akrylharts direkt i polyimid slangar, som är relativt transparent för röntgen. Häri, beskrivs prov förberedelse förfaranden för proverna från 0,5 till 10 mm i diameter, som skulle vara lämpliga för hela zebrafiskar larver och yngel, eller andra djur och vävnadsprover på liknande dimensioner. Som bevis på koncept, har vi inbäddade exemplaren från Danio, Drosophila, Daphniaoch en mus embryo; representativa bilder från 3-dimensionell genomsökningar för tre av dessa prover redovisas. Ännu viktigare, leder vår metod till flera fördelar inklusive styv immobilisering, långtidslagring av mödosamt skapade resurser och möjligheten att åter förhöra prover.
Fenotyper är observerbara egenskaper av en organism som representerar konsekvenserna av unika interaktioner mellan dess genetiska bakgrund och miljö. Dessa egenskaper kan inkludera beteendemässiga, biokemisk, morfologisk, utvecklingsmässiga eller fysiologiska egenskaper. Ännu viktigare, kan skillnader i egenskaper mellan vildtyps-organismer och genetiska mutanter ge viktiga insikt mekanismer och funktioner av drabbade gener. Vad gäller morfologi, histopatologi är den gyllene standarden för att bedöma fenotyper på cellnivå men lider mekaniska artefakter och tillåter inte exakt kvantitativ volymetrisk analys1. Vårt laboratorium är motiverade att övervinna hinder för tillämpningen av diagnostiska kraften i histologi på full vävnad volymer submicron upplösning.
En undersökning av tillgänglig teknik föreslår att avbildning av röntgen mikro-beräknade datortomografi (mikro-CT) kan ge perfekt kapacitet som krävs för millimeter-skala hela-djur 3-dimensionell (3D) histologi. Micro-CT kan icke-förstörande, isotropa, 3D visualisering och förmågan att genomföra kvantitativ analys av vävnad arkitektur1,2. Under de senaste åren 3D imaging av ofärgade och metall-färgas zebrafiskar av mikro-CT har fått ökande dragkraft och har använts för volymetrisk analys av flera vävnader, inklusive muskler, tänder, ben och fettvävnad3,4 ,5,6,7,8,9,10. Andra modellorganismer och vävnadsprover är också mottagliga för mikro-CT imaging. Exempelvis har en pipeline införts för att kvantifiera tät tem neuroanatomi av mus hjärnor avbildade via synkrotron mikro-CT11. Likaså har en eosin-baserat färgning protokoll visat sig vara lämplig för mjuk vävnad mikro-CT-avbildning av hela musen organ12. Morfometriska analys av ofärgade mänskliga L3 Kotor och visualisering av silver-färgade människors lungor med mikro-CT har visat nyttan av denna teknik för mänskliga prover13,14.
För att aktualisera den mycket lovande för mikro-CT för komplett morfologiska fenotypning av intakt smådjur och vävnadsprover, ett antal hinder som måste övervinnas i förhållande till genomströmning, upplösning, field-of-view, omfattande cell färgning, och långsiktigt bevarande. Medan var och en av dessa aspekter är kritiskt viktigt, är fokus i det nuvarande manuskriptet optimering av inbäddning rutiner, med ytterligare anteckningar på prov fixering och färgning. Heavy metal färgning är användbar eftersom den inneboende kontrasten mellan olika mjukdelar i mikro-CT-bilder är låg. Styrkan hos olika metall fläckar, såsom osmium vanligtvis, jod, phosphotungstic syra (PTA) och gallocyanin-chromalum, för att förbättra kontrast för mikro-CT imaging har varit studerade15,16,17. Uranyl acetat har också använts som en kontrasterande agent för mikro-CT-avbildning av ben och brosk18,19. PTA som används i våra protokoll leder till konsekvent färgning av nästan alla vävnader och celler i hela zebrafiskar exemplar, vilket ger bilder som är potentiellt kompatibla med histologi-liknande studier genom hela volymer av vävnad.
Under mikro-CT bild förvärv, en 2-dimensionell (2D) projektion tas som provet är roterade av en bråkdel av en grad och upprepas tills provet har slutfört en 180° eller 360° rotation, generera en serie av tusentals 2D prognoser används för den rekonstruktion av 3D-volym20. I denna process orsakar någon störning av preparatet motsvarande 2D prognoserna att vara ur läge, vilket resulterar i dåligt rekonstruerade 3D volymer. Prov immobilisering är ett sätt att rätta till problemet och några aktuella strategier innebär dränka provet i alkohol eller inbäddning i agaros i polypropylene rören eller mikropipett tips3,5,15, 16 , 21 , 22. flytande nedsänkning metoder är inte idealiska eftersom provet rörelse under bild förvärv kan uppstå mellan imaging uppsättningar, vilket resulterar i skiftade rekonstruktioner av 3D volymer23. Vidare är det väl känt att fysisk stabilitet av vätska-lagrade vävnadsprover är fattig på tidsskalor av månader till år, på grund av kemisk instabilitet och ytan nötning förknippas med rörelse av kontaktpunkter mellan prov och kärlet vägg ( personliga observationer med fasta djur- och vävnadsprover).
För att minska risken för provet rörelse under imaging, prover kan bäddas i agaros24,25,26, men denna praxis är associerade med risken att fläcken sprida in agaros vilket minskar bilden kontrast26. Dessutom vätska eller agaros preparat är benägna att fysiska skador och försämras med tiden, vilket gör dem olämpliga för långsiktig förvaring av provet. Vi resonerade att en potentiellt framgångsrika och okomplicerat prov immobilisering metod kunde anpassas från det som används för elektronmikroskopi exemplar. Polymeriserat hartser såsom EPON 812 (slopas och ersätts med bädda in 812) används ofta för att ge den hårdhet som krävs för att generera ultrathin sektioner för elektronmikroskopi27,28. Faktiskt, flera jämförande studier mellan röntgenfotografering och elektronmikroskopi har visat att de prover som inbäddade i harts kan avbildas med röntgen mikroskopi29,30. Några av standard praxis för elektronmikroskopi översätter dock inte direkt till mikro-CT imaging. Till exempel mikro-CT-avbildning av prover med fyrkant harts kanter av typiska harts block och prov klipp från dessa block är associerad med kant diffraction artefakter som kan störa imaging. Smoothing harts kanter, samtidigt som möjligt, är mödosam och tidskrävande.
Medan en mängd plast inbäddning hartser är anställda i elektronmikroskopi, ledde hög bakgrunden är associerad med hårdare hartser såsom bädda in 812 oss att testa andra. Vi valde LR vit på grund av dess låga viskositet, låg krympning, låg tendens att bilda bubblor under polymerisation och lägre bakgrund. Att skapa edge-gratis prover, och att minimera mängden harts som omger provet, utvecklat vi protokollen för att rita exemplar i flytande harts till polyimid slangar före polymerisation. Polyimid valdes för dess hög termisk stabilitet och hög röntgen transmittans så att borttagningen av slangen inte är nödvändigt för avbildning. Slutligen har vi utformat en anpassad mikropipett adapter för vårt urval bädda in tekniken för att tillförlitligt håll slangen och förhindra kontaminering av Mikropipetter. Adaptern kan vara 3D tryckt från en CAD fil. Sammantaget är målet med de prov förberedelse metoder som presenteras här att göra inbäddning av små prover mer rättframt, uppnå förbättrad färgning kontrast, styv immobilisering och långsiktig lagring av intakt millimeter-skala exemplar.
I detta manuskript presenterar vi ett detaljerat protokoll för styv immobilisering av fasta och färgade millimeter-skala (0,5 till 2,5 mm diameter) exemplar för mikro-CT bilddiagnostik. Med tanke på den snabba utvecklingen av mikro-CT teknik när det gäller upplösning och hastighet, är en metod för permanent prov bevarande med nytt imaging funktioner mycket önskvärt. Traditionellt används ofta tät inbäddning harts i elektronmikroskopi för att ge strukturellt stöd för att minska ultrathin sektioner och minimera skadorna på preparatet. Vår metod anpassad dess användning för styv immobilisering under icke-förstörande bildbehandling. För att minimera de imaging artefakterna från förekomsten av överskjutande harts, har vi genomfört användningen av röntgen transparent polyimid slangar att skapa runda prover utan kanter, och att begränsa mängden harts runt provet.
Optimala resultatet av inbäddning förfarandet villkoras försiktig körning av flera kritiska moment och uppmärksamhet till provet integritet under hela förfarandet. Faktiskt kommer att skadar preparatet resultera i en komprometterad slutliga bilden oavsett framgången för utförandet av imaging. Eftersom kylning bidrar till en minskning av smärta svaren och ofixerad vävnad bryts ned snabbare vid högre temperaturer, använder vi pre kylda reagenser. Stora exemplar kan behöva sänkas för att tillåta införsel av fixativ till insidan av preparatet så att inre organ såsom lever, bukspottkörtel och tarm är helt fasta. Ofixerade vävnader försämras och förlorar strukturell integritet, förstöra biologisk struktur. Ett annat viktigt steg är att upprätthålla förlagan i sin naturliga anpassning. Därför förespråkar vi för användning av flatbottnad behållare, som vi använder under hela förfarandet och är särskilt viktigt under fixering. Fixering i polypropylen rör eller koniska rör som vanligtvis har en V-formad botten bör undvikas eftersom de kan orsaka långsträckt prover att böja, vilket snedvrider den naturliga morfologin av preparatet. Dessutom, för att minimera användningen av harts, är den inre diametern av polyimid slangen bara något större än bredden på preparatet. Böjning av preparatet kan också resultera i skador till preparatet som det går in slangen. Det rekommenderas också att överföra preparatet i slangen i en naturlig framåt sätt att undvika skadliga extremiteter. Ordentlig uttorkning är ett annat viktigt steg. Detta görs med små steg av ökande EtOH koncentrationer att långsamt byta vatten med EtOH, vilket är mer blandbart med harts. Stora ökningar i EtOH koncentration är associerade med vävnad krympning och kan förbättras genom ytterligare steg om EtOH inkubation att göra övergången mer gradvis. Slutligen, för att minimera rörelsen av preparatet eller luftfickor, om det finns några, proverna placeras horisontellt under harts polymerisation (slutet av dag 4). Luftfickor eller tätningsmedel bredvid preparatet orsakar optiska artefakter med röntgenfotografering associerade med kant diffraction, minska bildkvaliteten.
När det gäller eventuella ändringar av protokollet, andra inbäddning hartser och metall fläckar kan användas i stället för LR vit akryl och PTA, respektive. Embed812, ett epoxiharts som vanligen används i elektronmikroskopi, är mycket trögflytande, svårare att överföra, kan orsaka snedvridning av exemplaren och associeras med högre bakgrund än akryl eller glykol metakrylatresiner. Medan JB4 Plus, en glykol form, är mindre trögflytande än EMbed812 och har lägre bakgrund, slumpmässiga bildandet av luftfickor ofta visas i närheten av preparatet. Som nämnts, luftfickor försämra bildkvaliteten och är särskilt problematiska för dyrbara prover. Det är värt att notera att Technovit 7100, en annan glykol form, stör PTA färgning, vilket resulterar i dålig kontrast i den slutliga bilden. Jämförelsevis, LR vit akryl har vatten-liknande viskositet, låg bakgrund, och stör inte PTA färgning. I våra händer är framgången för inbäddning i LR vitt utan provet skador eller luftbubblor större än 95%. Av dessa skäl har förespråkar vi dess användning som inbäddning kådan för vävnad mikro-CT. När det gäller fläckar, resultatet av olika metall fläckar såsom osmium vanligtvis, jod, och PTA i mikro-CT imaging har varit jämförs och diskuteras på annat håll15,16,17 och ligger utanför tillämpningsområdet för denna Manuskriptet.
Urvalets storlek är en stor begränsning till vår nuvarande protokoll. Eftersom vi anställer sug att överföra exemplar i slangen, är förmågan att se preparatet kritiska för orientering och säkerställa att det verkligen är i slangen. Som ett resultat, sub millimeter prover såsom trögkrypare (dvs., vatten björnar) är extremt svåra att bädda in eftersom de kräver användning ett mikroskop för att visualiseras. När sug är tillämpas, mikroskopiska exemplar försvinner enkelt från fokalplanet och bli utmanande att återupptäcka, vilket gör det svårt att avgöra om de gått för långt genom bifogade slutet av slangen. Större prover, såsom musembryon, (3-10 mm) kan bäddas med smärre ändringar av inbäddning protokoll (figur 4 d). I synnerhet var polyimid slangen fylld till 1/3 med flytande harts, som var polymeriseras före inbäddning. Fasta och färgas provet placerades ovanpå före polymeriserat kådan. Slangen var sedan helt fylld med un-polymeriserat harts och följt av en andra polymerisation.
Betydelsen av vårt inbäddning protokoll är mångfacetterad. Stelt immobiliserade hela djuret eller vävnad prover är önskvärda av anledningar: (1) att skapa långsiktiga förråd av prover som är svåra att generera eller förbereda; (2) nytt förvärv av data; (3) Aktivera följetong imaging använder flera avbildningsmetoder; (4) att ge normer för kalibrering och teknisk utveckling. Prover som tillagas med vårt förfarande för inbäddning är inneslutna i fast harts som är motståndskraftig mot skador och därför lätt kan lagras kanske på obestämd tid. Långsiktig lagring är särskilt användbar för sällsynta eller mödosamt genererade prover såsom de som förknippas med företeelser projekt. Ytterligare, i händelse av att de digitala data går förlorade, data kan genereras från det ursprungliga provet. Kapaciteten hos ny avbildning under en lång tidsperiod potentiellt tillåter samma prov att förhöras med mer avancerade imaging modaliteter i framtiden. Eftersom proverna är fysiskt stabil mellan imaging instanser, förvärvas bilder från samma prov i samma riktning, underlätta registrering mellan tidigare och senare datamängder. Exempelvis kan en lågupplöst bild Tillåt endast segmentering av vävnader i en zebrafiskar larv. Samma larven kan senare avbildas åter på högre upplösning så att mer detaljerad computational analyser på cellulära upplösning. Denna förmåga för direkt jämförelse mellan registrerade skanningar föreslår harts-embedded prover som en potential som är standard för teknikutveckling av mikro-CT. Effekterna av eventuella ändringar av metoden imaging kan bedömas av imaging av samma prov så att alla variabler i prov förberedelse steg kontrolleras. Slutligen, ett harts-embedded standardprov kan användas för instrumentkalibrering för att testa för konsekvens för bildframställning.
Vårt tidigare arbete att undersöka muterade och sjuka fiskar histologi visade att cellulära upplösning tillåter upptäckt av subtila avvikelser i vävnad struktur som förbises i brutto undersökning med den dissekera Mikroskop36eller en lågenergi- stereo Mikroskop. Vi vill utöka våra högupplösta analyser till mänskliga prover. Zebrafiskar larver, som utgör den primära frågan om vårt utvecklingsarbete, liknar mänskliga nål biopsier i sin bräcklighet, cellulära och intercellulära vävnad heterogenitet, storlek (1-3 mm diameter) och avlånga. Baserat på vår omfattande erfarenhet med zebrafiskar och annat arbete som visar att mikro-CT framgång målat och skannas mänsklig vävnad, om än i lägre upplösning37, vi förväntar oss att våra metoder för att tillföra mervärde till bildhantering och analys av nålen biopsier. Vi har uppskattat att monteringen av ett kit som är tillräcklig för en beredning av upp till 20 prover av samma skick vara potentiellt mindre än 30 USD. De prover som utarbetats av vår inbäddning metod är resistenta mot fysiska skador och därför lätt att transportera. Den låg kostnad och enkel transport föreslår möjligheten att insamling av prover från hela världen, särskilt områden som cellulära resolution imaging med mikro-CT inte är lättillgänglig. Vår vision är att högupplösta digitala filer av nålen biopsier (allt från 0,1 till flera terabyte) att möjliggöra skapandet av en digital atlas av mänskliga vävnader, och samtidigt ge forskarna att förfina och förbättra nuvarande analys rörledningar för lokalisering och kvantitativa karakterisering av cellulär och vävnad arkitekturen inom 3D vävnader skannas.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Roland Myers för vänligt att ge de ursprungliga TEM-protokoll. Dessutom vill vi tacka Dr John Colbourne för att tillhandahålla Daphnia preparatet, Dr Santhosh Girirajan för att tillhandahålla Drosophila preparatet och Dr Fadia Kamal för att tillhandahålla mus embryot. Utredarna bekräftar finansieringsstöd från NIH (1R24OD18559-01-A2, PI: KCC), Jake Gittlen laboratorier för cancerforskning och från pilot award finansiering från PSU Huck instituten av biovetenskap och Institutet för CyberScience.
10X Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
Phosphotunstic Acid | VWR | MK282402 | |
Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | MS-222 | |
LR White | Electron Microscopy Sciences | 14380 | |
Polyimide tubing (ID 0.04") | Nordson Medical | 141-0065 | The exact polyimide tubings described in the manuscript are no longer available. A close match is provided here. Tubing with custom diameter can be manufactured upon request. |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
Oil-based soft modeling clay | Sculpey | S302 001 | |
Micropipette P200 | Gilson | F123601 | |
Micropipette P1000 | Gilson | F123502 | |
Glass vials | VWR | 66015-042 | |
V-shaped basin | VWR | 89094-676 | |
Weigh boats | VWR | 10803-148 | |
200 μL yellow micropipette tip | Fisher Scientific | 02-707-500 | |
1 mL blue micropipette tip | Fisher Scientific | 02-681-163 | |
Tabletop shaker | Thermolyne | M71735 | |
Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 CCD | |
X-ray microscope | Zeiss | Xradia 520 Versa |