Isolamento e Decellularization de um pâncreas todo porcino

Summary

Engenharia de tecidos do pâncreas inteiro é um desafio por causa de suas funções endócrinas e exócrinas. Vamos mostrar um método para a dissecação de uma pâncreas de suínos intactas e o processo de decellularization bem sucedido por perfusão de detergentes Triton X-100 Deoxycholate do sódio e desoxirribonuclease.

Abstract

Engenharia de tecidos do pâncreas inteiro pode melhorar os tratamentos atuais para diabetes mellitus. O objetivo final é pâncreas de engenheiro de tecido de uma origem xenogénica ou alogênico com células humanas. Uma demonstração de métodos para a dissecção eficiente, decellularization e recellularization do pâncreas de suínos pode beneficiar o campo. Semelhante à humanas pancreases, pancreases porcinos tem um arranjo anatômico especial com três lóbulos (esplênica, duodenal e conexão) arredondado pelo duodeno e intestino delgado. O lobo duodenal do pâncreas ligada ao duodeno por vários pequenos vasos sanguíneos. Engenharia de tecidos do pâncreas é complicada por causa de sua natureza endócrino e exócrina. Neste trabalho, mostramos um protocolo detalhado para dissecar o pâncreas inteiro suíno e decellularize-lo com detergentes, poupando sua estrutura e alguns componentes de matriz extracelular. Para alcançar a completa perfusão, a aorta é escolhida como entrada e a veia porta como saída. São ligados a outros vasos sanguíneos (artéria hepática, veia esplênica, artéria esplênica, árvore de artéria e veia mesentérica) e ducto biliar. Para evitar a formação de trombos, o porco é heparinizado e, imediatamente após a dissecação, o órgão é lavado com heparina fria. Para inibir a ação das enzimas exócrinas, o decellularization do pâncreas situa-se a 4 ° C. O decellularization é realizado por perfusão de Triton X-100 Deoxycholate do sódio e desoxirribonuclease, com uma lavagem extensiva intermitente e final. Com uma decellularization bem sucedida, o pâncreas aparece branco, e uma avaliação histológica com hematoxilina e eosina mostra uma ausência de núcleos com estrutura preservada da matriz extracelular. Assim, o método proposto pode ser usado para dissecar e decellularize pâncreas inteiro porcina com êxito.

Introduction

Diabetes mellitus é caracterizada pela presença de aumento dos níveis de glicose no sangue. É reconhecido como um desafio de saúde pública na maioria dos países¹. Níveis elevados de glicose no sangue afetam os vasos sanguíneos e sistema nervoso, causando danos para os olhos, o coração e os rins e isquemia de extremidade. Os métodos tradicionais de tratamento incluem injeções de insulina exógena, drogas e mudanças de estilo de vida. Deixando de lado uma cura para a doença, em alguns casos, tratamentos disponíveis não conseguem manter a insulina em níveis terapêuticos, resultando em hiperglicemia. Embora o transplante de ilhotas ou pâncreas inteira elimina a doença, isso não é feito comumente por causa de uma escassez de órgãos de doador e os riscos e dificuldades de imunossupressão e encapsulamento².

Melhorias atuais no campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos possuem a capacidade para fornecer uma solução para estas questões. Com a técnica de decellularization, o material celular de um doador humano ou animal pode ser removido enquanto as proteínas importantes da matriz extracelular (ECM), fatores de crescimento, e moléculas sinalizadoras são preservadas no cadafalso. Tais andaimes podem potencialmente ser transplantados sem a necessidade de imunossupressão, para restaurar a função do órgão após recellularization com a células-tronco não-imunogênico^{3,4 do próprio destinatário}. Os órgãos de engenharia de tecidos de alogênico ou xenogénicas fontes podem ser usados em transplante clínico, como as proteínas da matriz extracelular principais são conservadas entre as espécies e não podem ser rejeitadas após transplante⁵.

Decellularization é um método bem explorado envolvendo o uso ideal de forças físicas, detergentes químicos e enzimas num ambiente fisiológico para remover o material nuclear e células de um tecido ou órgão. Recellularization é um procedimento de semeadura de células volta para o órgão acelular. É um procedimento intelectualmente difíceis, que exigem um grande número de células, uma melhor estratégia de célula-semeadura e um sistema de biorreator para a cultura do órgão em condições fisiologicamente aceitáveis, como temperatura, pressão e gases⁶.

O pâncreas pode ser considerado um tecido desafiador para a engenharia de tecidos por causa de suas capacidades exócrinas e endócrinas. O tecido exócrino secreta várias enzimas digestivas, enquanto que a parte endócrina segrega hormonas, incluindo a insulina. O decellularization de pancreases intactas de rato^7,8, humano⁹e porco¹⁰ já foi relatado usando enzimas (tripsina, desoxirribonuclease [DNase]) e não-iônicos (Triton X-100) e detergentes iônicos ( de sódio Deoxycholate. do [SDC] e sulfato dodecyl de sódio [SDS]). No entanto, seguindo os protocolos publicados, lutamos com um bem sucedida dissecação e perfusão completa e decellularization, mantendo uma estrutura de ECM. Nós especulamos que os detergentes aplicados durante a decellularization causam a Lise das células, assim liberando enzimas digestivas para o órgão. As enzimas lançadas irão causar um dano irreversível para o cadafalso de ECM e torná-lo ineficiente para decellularization e recellularization. Um projeto do método que efetivamente decellularizes pâncreas ao inibir a ação de enzimas digestivas pode resolver o problema. Escolhemos a estratégia da Peloso et al, do decellularization do pâncreas em uma temperatura fria, embora eles não informaram sobre por que a temperatura fria é usado⁹. Ao mesmo tempo, desenhamos uma estratégia de dissecação com modificações de Taylor et al , escolhendo a aorta como uma entrada de perfusão ao longo do tronco celíaca (CT) e a artéria mesentérica superior (SMA)¹¹.

Em um artigo recentemente publicado¹², vamos demonstrar um método para o isolamento eficaz e decellularization do pâncreas de suínos, preservando alguns componentes de ECM. Neste trabalho, podemos mostrar uma descrição detalhada de como dissecar um pâncreas todo porcino contendo esplênica, duodenal e lóbulos de conexão e apresentar um protocolo gradual para decellularization bem sucedido.

Protocol

A dissecação de um pâncreas de suínos e o procedimento de decellularization apresentado aqui seguir as diretrizes éticas da Universidade de Gotemburgo. 1. preparação de afinação Decellularization Usando tubos de silicone 3 x 5 mm, ligar em série o recipiente de detergente da entrada para a bomba de peristalic e em seguida para o pâncreas no órgão câmara através do desgaseificador (ver Figura 1). Conecte um conector luer macho à extremidade livre do tubo na câmara de órgão. Com outro tubo de silicone de 3 x 5 mm, ligue a câmara de órgão o detergente tomada recipiente através da bomba peristáltica para coletar o detergente perfundido. Conecte as extremidades livres dos tubos em cointainer de tomada de contêiner e detergente detergente da entrada, uma pipeta de 2ml sem rótulo. Manter a afinação toda a 4 ° C. Figura 1: preparação de set-up a perfusão. Usando um tubo de silicone de 3 x 5 mm, conforme mostrado na configuração, ligar em série o recipiente de detergente da entrada para a bomba peristáltica, o desgaseificador e câmara de órgão. As setas pretas mostram a direção do fluxo do recipiente de detergente da entrada para a câmara de órgão. Para a tomada de detergente, use um outro tubo de silicone de 3 x 5 mm e conectar o órgão câmara através da bomba peristáltica para o recipiente de detergente da tomada. As setas vermelhas mostram a direção do fluxo da câmara do órgão para o recipiente de detergente da tomada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. preparação de soluções de Decellularization Solução 1 (tampão fosfato salino [PBS]): adicionar 8 g de cloreto de sódio (137 mM), 0,2 g de cloreto de potássio (2.7 mM), 1,44 g de fosfato de sódio (10 mM) e 0,24 g de fosfato de potássio (1,8 mM) para 1 litro de água ultrapura e mexa até dissolver. Ajuste o pH para 7,4 com ácido clorídrico (HCl). No total, 3,2 L desta solução é necessária. Solução 2 (PBS + heparina): para 1 L de solução 1, adicionar 3,4 mL de heparina (17 unidades internacionais [IU] /mL). Preparar esta solução fresca e mantê-lo no gelo, até que ele se torna frio. No total, 1,2 L desta solução é necessária. Solução 3 (água ultrapura, azida de sódio + dissódico ácido etilenodiaminotetracético [EDTA]): para 1 L de água ultrapura, adicionar 1,86 g de EDTA (5 mM) e 200 mg de azida de sódio (0.02%). Mexa até que os sais são dissolvidos. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. No total, 22 L desta solução é necessária. Solução 4 (PBS, azida de sódio + EDTA): para 1 L de solução 1, adicionar 200 mg de azida de sódio (0.02%) e 1,86 g de EDTA (5 mM). Mexa até que os sais são dissolvidos. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. No total, 1 L dessa solução é necessária. Solução 5 (água ultrapura + azida de sódio): para 1 L de água ultrapura, adicionar 200 mg de azida de sódio (0.02%). Mexa até que os sais são dissolvidos. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. No total, 260 L desta solução é necessária.Nota: O EDTA forma um precipitado com SDC e foi excluído da solução 5, uma vez que será usado para a lavagem imediata, antes e após o tratamento da SDC. Solução 6 (SDC + Triton X-100): A 940 mL de água ultrapura, adicionar 40 g (4%) SDC, 60 mL de (6%) Triton X-100, 200 mg de azida de sódio (0.02%) e 69,6 mg de fluoreto de phenylmethylsulfonyl (0,4 mM) (PMSF). Mexa até dissolver. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. Adicione PMSF antes do uso. No total, 9,6 L desta solução é necessária. Solução 7 (DNase): Unidades adicionar 10.000 Kunitz de DNase-eu em 250 mL de PBS de Dulbecco (40 Kunitz unidades/mL) contendo CaCl2 e MgCl2. Prepare fresco e usá-lo imediatamente. Aquecer a solução a 37 ° C antes do uso. Solução 8 (PBS + sódio azida): para 1 L de solução 1, adicionar 200 mg de azida de sódio (0.02%). Mexa até que os sais são dissolvidos. Legal a solução a 4 ° C antes do uso. No total, 1 L dessa solução é necessária. 3. dissecação do pâncreas dos suínos Nota: Neste estudo, pancreases suínos foram dissecados de sacrificados, porcos feminino heparinizado (400 UI/kg), com 45 kg de peso de uma fazenda. Coloque o porco na mesa de dissecação na posição supina. Faça uma incisão na linha média do processo de xiphoidal ao osso púbico (cerca de 40 cm) usando um bisturi, expondo todos os órgãos abdominais. Localize o esplênica, duodenal e lóbulos de conexão. Localize o nível da papila duodenal maior e ligate duodeno oralmente de que site usando duas suturas separadas. Ligate do esôfago inferior com dois fios de sutura separados e corte entre as ligaduras com uma tesoura para tirar o estômago. Separe o tecido conjuntivo do cólon para atingir o intestino delgado. Separe o tecido conjuntivo do cólon que atribui ao lobo esplênico do pâncreas. Remova o cólon do intestino após ligar as artérias. Encontrar a veia mesentérica inferior e a árvore da artéria mesentérica inferior e ligate com uma sutura onde aparecem caudalmente do pâncreas. Ligar a artéria esplênica e veia juntamente com uma sutura, perto do baço, em Hilo e distalmente cortar com uma tesoura para remover o baço. Siga o duodeno até os lóbulos duodenais e conexão estão desmarcados e ligam duodeno no final com duas suturas separadas. Dissecar a veia porta, ligam com uma sutura para evitar qualquer perda de sangue do fígado e cortar proximalmente a ligadura. A veia porta serve como uma saída durante a decellularization. Dissecar e ligar o ducto biliar e artéria hepática com dois fios de sutura. Corte distal para suturas. Encontrar a aorta sob a veia renal e dissecá-lo na direção cranial do músculo e do tecido conjuntivo, até atingir a área do pâncreas. Vire o pâncreas suavemente e dissecar a aorta, mantendo intacta, a SMA e o CT e cortar a aorta superior ao CT e inferiores à SMA com uma tesoura. Cortar o restante dos tecidos circundantes, com uma tesoura… e tirar o pâncreas. Utilizando uma seringa de 50 mL, conectada à cânula de 4mm arteriotomia, irrigue os órgãos através da aorta com solução 2 até que ele perfuses o órgão inteiro ou o órgão inteiro se torna frio. 4. preparação do pâncreas dos suínos para Decellularization Manter o pâncreas a 4 ° C ou em gelo durante todo o processo. Cortar as suturas do duodeno usando a tesoura, limpá-lo de comida nivelando 50-150 mL de água ultrapura, usando uma pipeta de 25 mL e ligá-lo novamente com suturas. Ligar uma das extremidades da aorta e todas as filiais, além da SMA e CT com suturas para evitar fugas. Inserir, do outro lado da aorta, uma cânula de 4mm arteriotomia e ligá-lo com suturas. Perfundir o pâncreas com solução de 3 para 1 h a 20 mL/min usando a instalação do decellularization.Nota: Prefill os tubos da bomba com solução 3 tal que nenhuma bolha entra o pâncreas. Procure qualquer fugas de todos os lados do órgão e ligate todas abertos ramos vasculares com suturas, exceto a veia porta. Congele o pâncreas a-20 ° C em solução 4 até o início da decellularization. 5. decellularization do pâncreas dos suínos Descongelar o pâncreas a 4 ° C. Execute a bomba peristáltica na configuração decellularization com solução de 3 a 20 mL/min, até que nenhuma bolha de ar é vista no tubo de entrada de detergente. Coloque o pâncreas no recipiente decellularization e conecte o tubo de entrada de detergente para a aorta do pâncreas. Lavar o órgão por perfusão com solução 3 durante a noite a 20 mL/min a 4 ° C. Despeje a solução deixada na câmara de órgão. Substitua a solução 3 solução 5 e perfundir o pâncreas por 30 min em 20 mL/min a 4 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão. Adicionar a solução 6 e perfundir o pâncreas para 8 h a 20 mL/min a 4 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão. Lavar o órgão por perfusão com solução 5 para 96 h a 20 mL/min a 4 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão. Preparar o pâncreas para tratamento de DNase recirculando 500ml de PBS de Dulbecco contendo CaCl2 e MgCl2 por 30 min a 37 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão. Adicionar 250 mL de solução 7 e perfundir o pâncreas por 4 h a 20 mL/min a 37 ° C. Despeje a solução na câmara de órgão. Lavar o órgão por perfusão com solução 5 para 120 h a 20 mL/min a 4 ° C. Armazene o órgão em solução 8 a 4 ° C por curtos períodos ou a-20 ° C por longos períodos. 6. verificação de Decellularization Usando a tesoura, corte – a 10-3mm biópsias de todos os lóbulos do pâncreas e corrigi-los em formol para 48 h à temperatura ambiente. Lave as peças em água ultrapura durante 15 min, processá-los em um processador de tecido seguindo protocolos padrão e incorporá-los em parafina. Corte 5 µm seções usando o micrótomo e manchá-las por hematoxilina e 0,2% alcoólica eosina Meyer (HE seguindo protocolos padrão). Ver os slides sob um microscópio para verificar se há perda de núcleos.Nota: Um pedaço de um tecido fresco processado da mesma forma pode ser usado como um controle para verificar a presença de núcleos.

Representative Results

Fotos de dissecação de pâncreas de suínos representativa, que podem ajudar a localizar e dissecando a artéria mesentérica inferior e veia a árvore, a veia porta, artéria hepática, ducto biliar e a aorta ramificando para CT e SMA, são mostradas na Figura 2A, 2Be 2C (amarelo flechas), respectivamente. A figura 3A mostra a morfologia bruta de um pâncreas normal, que aparece luz rosa e contém esplênica, conexão e lóbulos duodenais. Depois de decellularization, a cor rosa está perdida e decellularized pâncreas parece branco pálido na cor. O quadro de morfologia bruta mostrando esplênica, conexão e duodenais lóbulos de um pâncreas decellularized é mostrado na Figura 3B. A Figura 3 mostra a presença de muitos núcleos azuis em um pâncreas normal pela coloração com ele. Em um decellularized pâncreas, HE coloração mostrou uma perda de núcleos, como são vistos sem núcleos azuis (Figura 3D). Figura 2: fotos de uma dissecação do pâncreas suíno. (A) localização da árvore inferior de artéria e veia mesentérica (seta amarela). (B) ligadura da veia porta, artéria hepática e ducto biliar (seta amarela). (C) Aorta ramificando-se para o tronco celíaca e artéria mesentérica superior (seta amarela). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: bruta morfologia e ele mancha de pancreases normais e decellularized. (A) morfologia bruta de um pâncreas normal. (B) morfologia bruta de um pâncreas decellularized. Coloração (C), ele mostra a presença de núcleos azuis em um pâncreas normal. Coloração (D), ele mostra ausência de núcleos azuis em um pâncreas decellularized. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo proposto, usando de perfusão de SDC e Triton X-100 a 4 ° C, será decellularize o pâncreas inteiro porcina com êxito. O desafio nesta técnica é a dissecação do pâncreas intacto contendo todos os três lóbulos sem danificar o parênquima e seus navios de fornecimento, bem como a ligadura dos outros ramos vasculares da amostra para perfundir o órgão sem fugas. O pâncreas suíno tem uma anatomia diferente em comparação com o pâncreas humano. Ele consiste de três lobos e fica em contato com o intestino delgado por em parte ao seu redor. Dissequei o duodeno juntamente com o pâncreas, como vários pequenos vasos sanguíneos do pâncreas conecta o intestino. Durante os estudos de otimização, corte brusco destas embarcações de sangue mostrou escapamento e uma perfusão incompleta de soluções.

Desde que a aorta se conecta ao pâncreas através das artérias mesentéricas superiores e celíacos, escolhemos a aorta como uma entrada para manter a perfusão simples usando apenas uma cânula e, portanto, uma entrada. Em nossa experiência, a ligadura da aorta acima o CT e abaixo o SMA diminuirá o tempo de dissecação e reduz o risco de danificar qualquer um dos dois navios. Além de um porco heparinizado, notamos também que uma perfusão de heparina frio através da aorta imediatamente após a dissecação ajuda a alcançar a perfusão de soluções em todo o órgão. Podemos especular se isso ocorrer, impedindo a formação de coágulos de sangue nos vasos sanguíneos. A perfusão inicial de um pâncreas com água ultrapura após a dissecação irá lisar células vermelhas do sangue e remover os vestígios de sangue no órgão, prevenindo a formação de coágulos de sangue. Este período também pode ser usado para encontrar qualquer unligated pequenos ramos de veias e artérias, como o fluxo de sangue pode ser facilmente notado acima do fundo.

Optamos por manter o procedimento inteiro decellularization em baixas temperaturas (4 ° C), como isso vai dificultar a ação das enzimas exócrinas que liberam de células exócrinas do pâncreas. As enzimas exócrinas, quando não inibida, podem causar um efeito deletério sobre as células e o ECM, como eles podem digerir as membranas celulares e proteínas¹². Como congelar e descongelar efetivamente podem estourar as células, nós incluímos uma etapa de congelamento/descongelamento, inicialmente antes mesmo da perfusão de detergentes^4,13. A lavagem inicial após a descongelação irá remover os restos de estouros de pilha. O detergente tratamento usamos é uma mistura de SDC e Triton X-100 em concentrações anormalmente elevadas e a uma velocidade de perfusão elevada. Optamos por esta abordagem para atingir mais rápido decellularization, removendo as células exócrinas que danificam o ECM. Podemos especular que um protocolo duro e rápido é benéfico para decellularization do pâncreas, como menos tempo estará disponível para as enzimas pancreáticas interagir com o ECM, preservando assim boas componentes de ECM. Para preservar os componentes do ECM, nós também adicionamos inibidor de protease de serina (PMSF) para as soluções de detergente, como isso vai inibir a ativação de enzimas liberado das células exócrinas¹⁴. Azida de sódio é adicionada a todas as soluções de decellularization, como ele atua como um agente bacteriostático, inibindo assim a chance de contaminação bacteriana¹⁵.

O pâncreas decellularized seguindo este protocolo mostrou uma preservação de estruturas ECM elastina e colágeno de proteínas de ECM. No entanto, observou-se uma perda significativa de glicosaminoglicanos no pâncreas decellularized. O pâncreas decellularized desta forma também mostrou a promessa para a fixação de células estaminais fetais no pâncreas e a expressão de marcadores endócrino e exócrinas em pedaços recellularized por 14 dias¹². No entanto, para gerar uma pâncreas intacta e funcional, uma pesquisa mais adicional é exigida na avaliação de fontes de célula correta, tipos de células, estratégias de propagação celular e cultura de biorreator.

Materials

4mm DLP arteriotomy cannula	Medtronic	31104
2ml Unlabelled pipette	vWR	612-3720
Degasser	Biotech AB	0001-6484
DNase-I	Worthington	LS0020007
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2	Sigma Aldrich	D8662
EDTA disodium salt dihydrate	AlfaAesar	A15161.OB
Heparin	Leo	387107
Luer Male with 1/8" ID Barb	Oina	LM-2PP-QC	For 3X5mm silicon tube
Peristaltic pump	Oina	SP-1X4
PMSF	Roche	10837091001	Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion.
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P5405
Potassium hydrogen phosphate	Sigma Aldrich	P9791
SDC	Sigma Aldrich	30970
Silicon tube 3X5mm	VWR	2280706
Sodium Azide	Sigma Aldrich	71290
Sodium chloride	Sigma Aldrich	13423
Sodium hydrogen phosphate	Merck	71640-M
Suture	Vömel	14817
Syrringe 50mL	Becton Dickinson	300137
Triton-X-100	AlfaAesar	A16046.OF