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Biochemistry

혐 기성 단백질 정화 및 DesB Dioxygenase 활동을 연구 하 고 억제를 위한 산소 전극을 통해 운동 분석

Published: October 03, 2018
doi:
10.3791/58307
, , , ,
1Department of Chemistry,Wesleyan University

Summary

여기 우리는 혐 기성 단백질 정화, 혐 기성 단백질 농도, 그리고 산소 전극 시스템을 사용 하 여 후속 운동 특성에 대 한 프로토콜을 제시. DesB, 더 안정적이 고 적극적인 정화 하 고 혐 기성 환경에서 저장 한 dioxygenase 효소 효소를 사용 하 여 메서드를 보여 줍니다.

Abstract

산소에 민감한 단백질, 그 효소를 활용 한 기질으로 산소를 포함 하 여 전통적인 호 기성 정화 방법을 사용 하 여 정화 하는 때 안정성을 줄일 수 있습니다. 이 원고에서는 장갑 상자에 담 론 전에 단백질의 버퍼 및 시 약, 열 착 색 인쇄기에 대 한 방법의 준비를 포함 하 여 혐 기성 정화 과정에 관련 된 기술적인 세부 사항을 보여 줍니다. 또한 준비 하 고 산소를 이용 하는 효소의 활동적인 특성화를 수행 하는 산소 전극 사용 방법이 있습니다. 이 메서드는 DesB, Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6 박테리아에서 gallate dioxygenase dioxygenase 효소를 사용 하 여 그림.

Introduction

철 또는 산소를 활성화 하기 위하여 다른 금속을 사용 하는 효소 들은 정화 과정 동안 비활성화에 취약 그들의 제거 때문에 셀의 줄이는 환경에서. 따라서이 단백질, 세포 lysates로 사용 해야 외부 감소 시키는 대리인를 복종 될 또는 있도록 그들은 최적 효소 활동1,2,,34anaerobically 정화. 그 효소는 산소에 민감한 (특히 철 분 포함 된 효소), 혐 기성 상태를 유지 하면서 모든 정화 및 특성화 단계를 수행 완전히 그들을 특성화 하는 데 필요한입니다. 이 주도하 고 있다 결정학5,6,7,8 단백질 표정에서 배열 하는 연구에 대 한 혐 기성 챔버의 범위 내에서 전체 실험실 체제를 개발 하는 연구원 .

여기, 우리는 혐 기성 정화 및 효소는 산소 전극 시스템을 사용 하 여 DesB의 운동 특성에 대 한 방법을 보고 합니다. DesB은 Sphingobium sp. 스트레인 SYK-6 LigAB, 동일한 유기 체에서 protocatecuate dioxygenase 관련 된 박테리아에서 gallate dioxygenase입니다. 두 효소 유형 II protocatechuate dioxygenase (PCAD) superfamily 날짜9, 에어로빅 표준을 사용 하 여 정화 하는 때 비활성화에 취약 되 고이 superfamily의 효소 때문에 가능성이 광범위 하 게 공부 하지는에 속한다 단백질 정화 방법입니다. PCAD 효소의 일부 표시 기판 성행위 동안 다른 기판 전용2,10, 추가이 superfamily의 특이성 결정을 식별 하는 데 필요한입니다. 으로 여러 효소 superfamilies11,12,13,,1415에 관찰 되었습니다, 작은 분자 직접 경쟁 저해를 통해 활동 또는의 바인딩을 변경할 수 있습니다. 분자 효소 활동16감소 또는 증가 일으키는 allosteric 주머니를 분리. 속도 론 혼자는 변조기의 바인딩 위치를 차별화 수 없습니다, 하는 동안 활동 변화의 크기를 결정 하는 것이 효과 이해 중요 합니다. 기본 DesB 활동과 4-nitrocatechol (4NC), 일반적으로 특성 및 dioxygenase 효소2,17, 를 억제 하는 데 사용 하는 화합물의 존재 그것의 활동의 운동 특성, 방법 18, 표시 됩니다.

DesB는 gallate, 리그 닌 파생 향기로운 화합물, 어떤 반지 여 기판10,19의 하나로 산소를 사용 하 여 촉매는 extradiol dioxygenase (에) 반응을 통해 무 너 뜨 리 수 있다. 이 효소 반응은 식물의 세포 벽에서 발견 한 향기로운 heteropolymer 리그 닌의 붕괴의 컨텍스트 내에서 발생 합니다. 리그 닌을 depolymerized 수 있습니다, 그리고 다양 한 방향족 화합물을 저조한 세분화 될 수 있습니다 추가 중앙 대사3,20,,2122,23,24에 ,25,26,,2728,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (에) 촉매 dihydroxylated 방향족 화합물, 금속 조정 diol;에 인접 한 분열이 발생에 반응 열 반지 대조적으로, intradiol dioxygenases 쪼개 두 개의 수 산 기 그룹 (그림 1) 간의 유사한 향기로운 화합물. 다른 많은 metalloenzymes 같은 EDOs 2 히스티딘, 1-카복실산 깡패9,,3435의 구성 조정 Fe(II) divalent 금속 센터가 있다. 이 metalloenzymes 될 산화, autoxidation 또는 비활성화 메커니즘에 기초를 둔 반면 효소 비활성2,36,,3738렌더링 됩니다.

이 원고에서 설명 하는 실험 절차에 우리 DesB, 박테리아 Sphingobium sp. SYK-6, gallate (그림 2A)의 c 4-c 5 본드에 걸쳐 산소의 추가 촉매 하에서 PCAD superfamily의 구성원을 사용 합니다. 이 분열의 regiochemistry는 유사한 LigAB, protocatechuate-4, 5-dioxygenase (그림 2B). 지금까지,이 gallate dioxygenase의 조사 DesB10,,1939을 억제 하는 화합물의 보고를 포함 한다. 호 기성 정화 방법의 사용으로 DesB 전시 변수 활동, 혐 기성 방법의 사용으로 일관 되 게 재현할 수 활동 단백질을 얻을 수 있었습니다. 여기에 설명 된 운동 연구 DesB, gallate와 DesB의 반응과 4-nitrocatechol (4NC)에 의해 DesB의 억제의 운동 특성의 혐 기성 정화에 대 한 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 일반 재료 및 방법 표 1에 설명 된 대로 모든 필요한 미디어를 준비 합니다. 압력솥에서 15 분 멸 균에 대 한 120 ˚C 0.2 µ m 필터를 통해 그것을 전달 하 여 MgCl2 , 포도 당의 추가 후 SOC 솔루션을 필터링 합니다. 압력가 마로 소독 전에 밀러의 Lysogeny 국물 (파운드 미디어) 솔루션의 pH를 조정 합니다. 0.2 m m L-시스테인, 다음 0.1 m m 철 암모늄 황산 단백질 표정 및 가용성을 향…

Representative Results

표시 된 개별 분수 정화 DesB-맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 퓨전 구문 (그림 3)에서 SDS 페이지 젤 분석이 이다. 젤 밝혀 단백질 순수 (MW = 91.22 kDa), DesB의 존재를 제외한 (MW = 49.22 kDa) MBP 단백질 도메인 (42 kDa) 서로 죽 습. 분수 E2 및 e 3은 농도 (4.2 단계)에 대 한 선정 됐다. DesB 운동 분석 실험에서 재현성 결과 ?…

Discussion

활성, 순화 DesB 단백질을 얻기에 있는 중요 한 단계는 형성 및 효소의 감소 Fe(II) 활성 사이트의 유지 관리를 포함 한다. 따라서, 유도, 정화, 농도, 성능 수정 하 고 염 단계는 활성 효소를 성공적으로 취득에 필수적인. Fe(II)을 DesB의 활성 사이트를 올바르게 통합 보장 1 mM 철 암모늄 황산의 단백질 발현을 유도 합니다. 이 메서드는 종종 적절 한 접는 수 있도록 성장 매체에 금속 추가 및 바인딩 사이?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 기술 지원에 대 한 웨슬리언 대학교의 박사 카밀 켈러를 감사 하 고 싶습니다. 혐 기성 단백질 정화 방법 및 O2의 사용에 관한 그들의 조언에 대 한 특별 감사 교수 린지 디 Eltis 제 나 K. Capyk 브리티시 컬럼비아의 대학에서 뿐만 아니라 오스틴에 있는 텍사스 대학에서에서 기독교 휘트먼 -민감한 전극.

Materials

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise Gold Bio Technologies I2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250 Bio-Rad 161-0400
Ammonium persulfate Bio-Rad 161-0700
30% Acrylamide Bio-Rad 161-0158
N,N'tetramethyl-ethylenediamine Bio-Rad 161-0801
Amylose Resin High Flow New England Biolabs E8022S
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells New England Biolabs C2527I
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
gallic acid Sigma Aldrich G7384
4-nitrocatechol Sigma Aldrich N15553
Ferrous ammonium sulfate Mallinckrodt 5064
Sodium dithionite Alfa Aesar 33381-22
wheaton serum bottles Fisher Scientific 06-406G
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane Pall Corportation 4187
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator EMD Millipore UFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter EMD Millipore PLGC07610
DL-dithiothreitol Gold Bio Technologies DTT50
Sephadex G-25 coarse desalting gal column GE Healthcare 17-0033-01
2 mL Crimp-Top Vials Fisher Scientific 03-391-38
Oxygraph Plus Electrode Control Unit Hansatech Instruments OXYG1 Plus
Oxygen Eletrode Chamber Hansatech Instruments DW1
Electrode Disc Hansatech Instruments S1
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel Hansatech Instruments S4
Electrode cleaning Kit Hansatech Instruments S16
Spacer paper Zig Zag available at any gas station
He-series Dri-Lab glove box Vacuum/Atmospheres Company
HE-493 Dri-Train Vacuum/Atmospheres Company
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula Fisher Scientific 21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific k420400-1530
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe Hamilton 80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column Fisher Scientific K420401-1505
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer Avestin
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent Thermo Fisher Scientific 89821
Lysozyme from chicken egg white Sigma Aldrich 12650-88-3
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 151-21-3
ampicillin Sigma Aldrich 7177-48-2
Tryptone Fisher Scientific BP-1421-500
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-2
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-10
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-3
Magnesium Chloride Fisher Scientific M33-500
Dextrose Fisher Scientific D16-3
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Tris hydrochloride Fisher Scientific BP153-500
Maltose Fisher Scientific BP684-500
Glycine Fisher Scientific G46-500
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References

  1. Awaya, J. D., Walton, C., Borthakur, D. The pydA-pydB fusion gene produces an active dioxygenase-hydrolase that degrades 3-hydroxy-4-pyridone, an intermediate of mimosine metabolism. Applied Microbiology and Biotechnology. 75 (3), 583-588 (2007).
  2. Barry, K. P., Taylor, E. A. Characterizing the Promiscuity of LigAB, a Lignin Catabolite Degrading Extradiol Dioxygenase from Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Biochemistry. 52 (38), 6724-6736 (2013).
  3. Colabroy, K. L., Smith, I. R., Vlahos, A. H. S., Markham, A. J., Jakubik, M. E. Defining a kinetic mechanism for l-DOPA 2,3 dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from Streptomyces lincolnensis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (3), 607-614 (2014).
  4. Imsand, E. M., Njeri, C. W., Ellis, H. R. Addition of an external electron donor to in vitro assays of cysteine dioxygenase precludes the need for exogenous iron. Archives of Biochemistry and Biophysics. 521 (1), 10-17 (2012).
  5. Tsai, C. -. L., Tainer, J. A., David, S. S. . Methods in Enzymology. 599, 157-196 (2018).
  6. Kuchenreuther, J. M., et al. High-Yield Expression of Heterologous [FeFe] Hydrogenases in Escherichia coli. Public Library of Science ONE. 5 (11), e15491 (2010).
  7. Dupuy, J., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction data for the aconitase form of human iron-regulatory protein 1. Acta Crystallographica Section F. 61 (5), 482-485 (2005).
  8. Fan, L., et al. XPD Helicase Structures and Activities: Insights into the Cancer and Aging Phenotypes from XPD Mutations. Cell. 133 (5), 789-800 (2008).
  9. Vaillancourt, F. H., Bolin, J. T., Eltis, L. D. The ins and outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 41, 241-267 (2006).
  10. Sugimoto, K., et al. Molecular Mechanism of Strict Substrate Specificity of an Extradiol Dioxygenase, DesB, Derived from Sphingobium sp. SYK-6. Public Library of Science ONE. 9 (3), e92249 (2014).
  11. Lewis-Ballester, A., et al. Structural insights into substrate and inhibitor binding sites in human indoleamine 2,3-dioxygenase 1. Nature Communications. 8, (2017).
  12. Lipscomb, J. D., Hoffman, B. M. Allosteric control of O-2 reactivity in Rieske oxygenases. Structure. 13 (5), 684-685 (2005).
  13. Mccray, J. A., Brady, F. O. Allosteric Control of Transient Kinetics of Carbon Monoxide-L-Tryptoohan-2,3-Dioxygenase Complex-Formation. Federation Proceedings. 32 (3), 469 (1973).
  14. Pearson, J. T., Siu, S., Meininger, D. P., Wienkers, L. C., Rock, D. A. In Vitro Modulation of Cytochrome P450 Reductase Supported Indoleamine 2,3-Dioxygenase Activity by Allosteric Effectors Cytochrome b(5) and Methylene Blue. Biochemistry. 49 (12), 2647-2656 (2010).
  15. Walsh, H. A., Daya, S. Inhibition of hepatic tryptophan-2,3-dioxygenase: Superior potency of melatonin over serotonin. Journal of Pineal Research. 23 (1), 20-23 (1997).
  16. Barry, K. P., et al. Exploring allosteric activation of LigAB from Sphingobium sp strain SYK-6 through kinetics, mutagenesis and computational studies. Archives of Biochemistry and Biophysics. 567, 35-45 (2015).
  17. Reynolds, M. F., et al. 4-Nitrocatechol as a probe of a Mn(II)-dependent extradiol-cleaving catechol dioxygenase (MndD): comparison with relevant Fe(II) and Mn(II) model complexes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 8 (3), 263-272 (2003).
  18. Tyson, C. A. 4-Nitrocatechol as a colorimetric probe for non-heme iron dioxygenases. Journal of Biological Chemistry. 250 (5), 1765-1770 (1975).
  19. Kasai, D., Masai, E., Miyauchi, K., Katayama, Y., Fukuda, M. Characterization of the gallate dioxygenase gene: Three distinct ring cleavage dioxygenases are involved in syringate degradation by Sphingomonas paucimobilis SYK-6. Journal of Bacteriology. 187 (15), 5067-5074 (2005).
  20. Billings, A. F., et al. Genome sequence and description of the anaerobic lignin-degrading bacterium Tolumonas lignolytica sp. nov. Standards in Genomic Sciences. 10 (1), 106 (2015).
  21. Brown, M. E., Chang, M. C. Y. Exploring bacterial lignin degradation. Current Opinion in Chemical Biology. 19, 1-7 (2014).
  22. Bugg, T. D. H., Ahmad, M., Hardiman, E. M., Rahmanpour, R. Pathways for degradation of lignin in bacteria and fungi. Natural Product Reports. 28 (12), 1883-1896 (2011).
  23. Clarkson, S. M., et al. Construction and Optimization of a Heterologous Pathway for Protocatechuate Catabolism in Escherichia coli Enables Bioconversion of Model Aromatic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 83 (18), (2017).
  24. de Gonzalo, G., Colpa, D. I., Habib, M. H. M., Fraaije, M. W. Bacterial enzymes involved in lignin degradation. Journal of Biotechnology. 236, 110-119 (2016).
  25. Falade, A. O., Eyisi, O. A. L., Mabinya, L. V., Nwodo, U. U., Okoh, A. I. Peroxidase production and ligninolytic potentials of fresh water bacteria Raoultella ornithinolytica and Ensifer adhaerens. Biotechnology Reports. 16, 12-17 (2017).
  26. Gall, D. L., Ralph, J., Donohue, T. J., Noguera, D. R. A Group of Sequence-Related Sphingomonad Enzymes Catalyzes Cleavage of β-Aryl Ether Linkages in Lignin β-Guaiacyl and β-Syringyl Ether Dimers. Environmental Science & Technology. 48 (20), 12454-12463 (2014).
  27. Li, J., Yuan, H., Yang, J. Bacteria and lignin degradation. Frontiers of Biology in China. 4 (1), 29-38 (2009).
  28. Masai, E., Katayama, Y., Nishikawa, S., Fukuda, M. Characterization of Sphingomonas paucimobilis SYK-6 genes involved in degradation of lignin-related compounds. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 23, 364-373 (1999).
  29. Morales, L. T., González-García, L. N., Orozco, M. C., Restrepo, S., Vives, M. J. The genomic study of an environmental isolate of Scedosporium apiospermum shows its metabolic potential to degrade hydrocarbons. Standards in Genomic Sciences. 12 (1), 71 (2017).
  30. Shettigar, M., et al. Isolation of the (+)-Pinoresinol-Mineralizing Pseudomonas sp. Strain SG-MS2 and Elucidation of Its Catabolic Pathway. Applied and Environmental Microbiology. 84 (4), (2018).
  31. Shi, Y., et al. Characterization and genomic analysis of kraft lignin biodegradation by the beta-proteobacterium Cupriavidus basilensis B-8. Biotechnology for Biofuels. 6 (1), 1 (2013).
  32. Varman, A. M., et al. Decoding how a soil bacterium extracts building blocks and metabolic energy from ligninolysis provides road map for lignin valorization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), E5802-E5811 (2016).
  33. Wu, W., et al. Lignin Valorization: Two Hybrid Biochemical Routes for the Conversion of Polymeric Lignin into Value-added Chemicals. Scientific Reports. 7 (1), 8420 (2017).
  34. Koehntop, K. D., Emerson, J. P., Que, L. The 2-His-1-carboxylate facial triad: a versatile platform for dioxygen activation by mononuclear non-heme iron(II) enzymes. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 10 (2), 87-93 (2005).
  35. Lipscomb, J. D. Mechanism of extradiol aromatic ring-cleaving dioxygenases. Current Opinion in Structural Biology. 18 (6), 644-649 (2008).
  36. Machonkin, T. E., Doerner, A. E. Substrate specificity of Sphingobium chlorophenolicum 2,6-dichlorohydroquinone 1,2-dioxygenase. Biochemistry. 50, 8899-8913 (2011).
  37. Suzuki, T., Kawamichi, H., Imai, K. Amino Acid Sequence, Spectral, Oxygen-Binding, and Autoxidation Properties of Indoleamine Dioxygenase-Like Myoglobin from the Gastropod Mollusc Turbo cornutus. Journal of Protein Chemistry. 17 (8), 817-826 (1998).
  38. Vaillancourt, F. H., Labbe, G., Drouin, N. M., Fortin, P. D., Eltis, L. D. The Mechanism-based Inactivation of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by Catecholic Substrates. Journal of Biological Chemistry. 277 (3), 2019-2027 (2002).
  39. Sugimoto, K., et al. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of gallate dioxygenase DesB from Sphingobium sp. SYK-6. Acta Crystallographica Section F. 65 (11), 1171-1174 (2009).
  40. Gallagher, S. R. SDS‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. 6 (1), 7.3.1-7.3.28 (2012).
  41. Xiang, D. F., et al. Function Discovery and Structural Characterization of a Methylphosphonate Esterase. Biochemistry. 54 (18), 2919-2930 (2015).
  42. Vladimirova, A., et al. Substrate Distortion and the Catalytic Reaction Mechanism of 5-Carboxyvanillate Decarboxylase. Journal of the American Chemical Society. 138 (3), 826-836 (2016).
  43. Korczynska, M., et al. Functional Annotation and Structural Characterization of a Novel Lactonase Hydrolyzing d-Xylono-1,4-lactone-5-phosphate and l-Arabino-1,4-lactone-5-phosphate. Biochemistry. 53 (28), 4727-4738 (2014).
  44. Netto, L. E. S., Stadtman, E. R. The Iron-Catalyzed Oxidation of Dithiothreitol Is a Biphasic Process: Hydrogen Peroxide Is Involved in the Initiation of a Free Radical Chain of Reactions. Archives of Biochemistry and Biophysics. 333 (1), 233-242 (1996).
  45. Arciero, D. M., Orville, A. M., Lipscomb, J. D. Protocatechuate 4,5-Dioxygenase from Pseudomonas testosteroni. Methods in Enzymology. 188, 89-95 (1990).
  46. Harpel, M. R., Lipscomb, J. D. Gentisate 1,2-dioxygenase from pseudomonas. Purification, characterization, and comparison of the enzymes from Pseudomonas testosteroni and Pseudomonas acidovorans. Journal of Biological Chemistry. 265 (11), 6301-6311 (1990).
  47. Ishida, T., Tanaka, H., Horiike, K. Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenase with broad substrate specificity. Journal of Biochemistry. 135 (6), 721-730 (2004).
  48. Vaillancourt, F. H., Han, S., Fortin, P. D., Bolin, J. T., Eltis, L. D. Molecular Basis for the Stabilization and Inhibition of 2,3-Dihydroxybiphenyl 1,2-Dioxygenase by t-Butanol. Journal of Biological Chemistry. 273 (52), 34887-34895 (1998).
  49. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386, 305-314 (2005).
  50. Wolgel, S. A., et al. Purification and Characterization of Protocatechuate 2,3-Dioxygenase from Bacillus macerans: a New Extradiol Catecholic Dioxygenase. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4414-4426 (1993).

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Uchendu, S. N., Rafalowski, A., Cohn, E. F., Davoren, L. W., Taylor, E. A. Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition. J. Vis. Exp. (140), e58307, doi:10.3791/58307 (2018).
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