Här presenterar vi ett protokoll för anaerob protein rening, anaerob proteinkoncentration och efterföljande kinetiska karakterisering använder ett syre elektrod system. Metoden illustreras med hjälp av enzymet DesB, en dioxygenas enzym som är mer stabil och aktiv när renat och lagras i en syrefri miljö.
Syre-känsliga proteiner, inklusive de enzymer som utnyttjar syre som substrat, kan har nedsatt stabilitet när renat med traditionella aerob reningsmetoder. Detta manuskript illustrerar de tekniska detaljerna som är involverade i reningsprocessen anaerob, inklusive utarbetandet av buffertar och reagenser, metoder för kolonnkromatografi i ett handskfacket och avsaltning av proteinet innan kinetik. Beskrev också är metoder för att förbereda och använda en syre-elektrod för kinetiska karakterisering av ett syre-utnyttja enzym. Dessa metoder är illustrerade med hjälp av enzymet dioxygenas DesB, en gallate dioxygenas från bakterien Sphingobium sp. stam SYK-6.
Enzymer som använder järn eller andra metaller för att aktivera syre är ofta känsliga för inaktivering under reningsprocessen på grund av deras avlägsna från reducerande miljö i en cell. Därför dessa proteiner måste användas som cellen lysates, underkastas extern reduktionsmedel eller renas anaerobt för att säkerställa att de har optimal enzymaktivitet1,2,3,4. För de enzymer som är är syre-känsliga (speciellt järn-innehållande enzymer), utför alla rening och karakterisering steg bibehållen anaeroba förhållanden nödvändigt att fullständigt karakterisera dem. Detta har lett forskare att utveckla hela laboratorium uppställningar inom ramarna för anaerob kammare för studier alltifrån proteinuttryck genom kristallografi5,6,7,8 .
Häri, rapporterar vi metoder för anaerob rening och kinetiska karakterisering av enzymet DesB använder ett syre elektrod system. DesB är en gallate dioxygenas från bakterien Sphingobium sp. stam SYK-6 som är relaterade till LigAB, en protocatecuate dioxygenas från samma organism. Båda enzymer hör till typ II protocatechuate dioxygenas (PCAD) överfamiljen som inte har studerats datum9, troligen delvis på grund av enzymer av denna superfamiljen att vara mottagliga för inaktivering när renat med standard aerob protein reningsmetoder. Eftersom några av enzymerna som PCAD Visa substrat promiskuitet medan andra är substrat-specifika2,10, vidare är karakterisering av denna Överfamilj nödvändigt att identifiera specificitet bestämningsfaktorer. Såsom har påpekats i flera enzym superfamilies11,12,13,14,15, kan små molekyler ändra aktiviteten via direkta kompetitiv hämning eller bindningen av molekyler till separata Alloster fickor som orsakar en ökning eller minskning av enzymaktivitet16. Medan kinetik ensam inte kan skilja bindande platsen för en modulator, avgöra omfattningen av en aktivitet förändringen är viktigt för att förstå effekterna. Som sådan, metoder för kinetiska karakterisering infödda DesB verksamhet och dess verksamhet i närvaro av 4-nitrocatechol (4NC), en förening som vanligen används för att karakterisera och hämmar dioxygenas enzymer2,17, 18, visas.
DesB är kunna bryta ner Epigallocatechingallat, en lignin-derived aromatisk förening, via en extradiol dioxygenas (EDO) reaktion i vilken ring öppnandet catalyzeds använder syre som en av substrat10,19. Detta enzymatisk reaktion inträffar inom ramen för fördelningen av lignin, en aromatisk heteropolymer Funna i cellväggen av växter. Lignin kan vara depolymerized, vilket ger en mängd aromatiska föreningar som kan ytterligare delas upp i centrala metaboliter3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol dioxygenases (EDO) katalyserar en ring öppning reaktion på dihydroxylated aromatiska föreningar, där klyvning sker i anslutning till en metall-samordnad diol; Däremot klyva intradiol dioxygenases liknande aromatiska föreningar mellan de två hydroxylgrupperna (figur 1). EDOs, som många andra metalloenzymes, har en tvåvärda metall center för samordnande Fe(II) består av en två-histidin, one-bildas triad9,34,35. Dessa metalloenzymes blir oxiderade, antingen genom autoxidation eller mekanism-baserade inaktivering, medan enzymet återges inaktiva2,36,37,38.
I de experimentella procedurer som beskrivs i detta manuskript, använder vi DesB, medlem av PCAD superfamiljen från det bakterie Sphingobium sp. SYK-6, katalysera tillsats av syre över C4-C5 förbindelsen av Epigallocatechingallat (figur 2A). Regiochemistry av denna klyvning är analogt med LigAB, som är en protocatechuate-4,5-dioxygenas (figur 2B). Hittills, inkluderar utredningar av detta gallate dioxygenas inga rapporter av föreningar som hämmar DesB10,19,39. Med användning av aerob reningsmetoder utställda DesB variabeln aktiviteten, medan med användning av anaerob metoder kunde vi konsekvent få protein med reproducerbara aktivitet. De kinetiska studier beskrivs här visar metoder för anaerob rening av DesB, kinetic karakterisering av reaktionen av DesB med Epigallocatechingallat, och hämning av DesB av 4-nitrocatechol (4NC).
De kritiska steg i att få aktiva, renat DesB protein innebär formning och bibehålla den reducera Fe(II) aktiva platsen i enzymet. Som sådan, korrigera prestanda av induktion, rening, koncentration och avsaltning steg är avgörande för framgångsrikt att få aktivt enzym. Inducerande proteinuttryck i närvaro av 1 mM järnhaltigt ammoniumsulfat säkerställer att Fe(II) korrekt införlivas i den aktiva platsen av DesB. Denna metod är inspirerad av studier som de med amidohydrolase metalloenzymes, som ofta kräver t…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Camille Keller Wesleyan University för teknisk support. Speciellt tack till Professor Lindsay D. Eltis och Jenna K. Capyk från University of British Columbia, samt Christian Whitman från University of Texas i Austin, för deras råd angående anaerob protein reningsmetoder och användning av en O2 -känslig elektrod.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodise | Gold Bio Technologies | I2481C50 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 161-0400 | |
Ammonium persulfate | Bio-Rad | 161-0700 | |
30% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0158 | |
N,N'tetramethyl-ethylenediamine | Bio-Rad | 161-0801 | |
Amylose Resin High Flow | New England Biolabs | E8022S | |
BL21 (DE3) competent Escherichia coli cells | New England Biolabs | C2527I | |
L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
gallic acid | Sigma Aldrich | G7384 | |
4-nitrocatechol | Sigma Aldrich | N15553 | |
Ferrous ammonium sulfate | Mallinckrodt | 5064 | |
Sodium dithionite | Alfa Aesar | 33381-22 | |
wheaton serum bottles | Fisher Scientific | 06-406G | |
25 mm Acrodisc PF Syringe Filter with Supor Membrane | Pall Corportation | 4187 | |
400 mL Amicon Stirred Cell Concentrator | EMD Millipore | UFSC40001 | |
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa cutoff reconsituted cellulose membrane filter | EMD Millipore | PLGC07610 | |
DL-dithiothreitol | Gold Bio Technologies | DTT50 | |
Sephadex G-25 coarse desalting gal column | GE Healthcare | 17-0033-01 | |
2 mL Crimp-Top Vials | Fisher Scientific | 03-391-38 | |
Oxygraph Plus Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | OXYG1 Plus | |
Oxygen Eletrode Chamber | Hansatech Instruments | DW1 | |
Electrode Disc | Hansatech Instruments | S1 | |
PTFE (0.0125 mmX25mm) 30m reel | Hansatech Instruments | S4 | |
Electrode cleaning Kit | Hansatech Instruments | S16 | |
Spacer paper | Zig Zag | available at any gas station | |
He-series Dri-Lab glove box | Vacuum/Atmospheres Company | ||
HE-493 Dri-Train | Vacuum/Atmospheres Company | ||
Double-Ended Micro-Tapered Stainless Steel Spatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | k420400-1530 | |
10 μL, Model 701 N SYR, Cemented NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2 syringe | Hamilton | 80300 | |
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy Column | Fisher Scientific | K420401-1505 | |
Emulsiflex-C5 high-pressure homogenizer | Avestin | ||
B-PER Complete Bacterial Protein Extraction Reagent | Thermo Fisher Scientific | 89821 | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma Aldrich | 12650-88-3 | |
Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fisher Scientific | 151-21-3 | |
ampicillin | Sigma Aldrich | 7177-48-2 | |
Tryptone | Fisher Scientific | BP-1421-500 | |
Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-10 | |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M33-500 | |
Dextrose | Fisher Scientific | D16-3 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
Tris hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
Maltose | Fisher Scientific | BP684-500 | |
Glycine | Fisher Scientific | G46-500 |