Analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et sécrétion

Wei Zhou; Petra Sipilä; Geoffry N. De Iuliis; Matthew D. Dun; Brett Nixon

doi:10.3791/58308

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Article de méthode

Analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et sécrétion

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DOI :

10.3791/58308

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25 août 2018

Wei Zhou¹^,² , Petra Sipilä³ , Geoffry N. De Iuliis¹^,² , Matthew D. Dun²^,⁴ , Brett Nixon¹^,²

¹Priority Research Centre for Reproductive Science, School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, ²Hunter Medical Research Institute, ³Department of Physiology, Turku Center for Disease Modeling, Institute of Biomedicine, University of Turku, ⁴School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle

Dans cet article

Résumé

Nous rapportons ici, la localisation de l’immunofluorescence de dynamine pour illustrer les protocoles pour la détection des protéines dans les sections dans l’épididyme de paraffine souris et ceux d’une lignée de cellules épididymaires immortalisé (mECap18). Nous décrivons également les protocoles pour l’isolement des protéines sécrétoires du fluide épididymaire et milieux cellulaires conditionné.

Résumé

L’épididyme mammifères génère l’un des fluides intraluminal plus complexes de toute glande endocrine afin de favoriser la maturation post-testiculaire et le stockage des spermatozoïdes. Une telle complexité se pose en raison de l’activité combinée de sécrétion et d’absorption des paroi des cellules épithéliales. Nous décrivons ici les techniques pour l’analyse de la synthèse des protéines dans l’épididyme et de la sécrétion en mettant l’accent sur la famille de protéine modèle de dynamine (DNM) mechanoenzymes ; grand GTPases qui ont le potentiel pour réglementer les événements trafic bidirectionnel membrane. Pour l’étude de l’expression des protéines dans les tissus dans l’épididyme, nous décrivons une méthodologie robuste pour l’immunofluorescence étiquetage des protéines cibles dans les sections de paraffine et la détection ultérieure de la distribution spatiale de ces protéines via la microscopie en immunofluorescence. Nous décrivons également méthodologie optimisée pour l’isolement et la caractérisation de l’exosome comme des vésicules, appelée epididymosomes, qui sont sécrétés dans la lumière dans l’épididyme de participer à la communication intercellulaire avec la maturation des spermatozoïdes. Comme une approche complémentaire, nous décrivons également la détection par immunofluorescence des protéines cibles dans une lignée de cellules épithéliales dans l’épididyme (mECap18) souris SV40-immortalisé caput. En outre, nous discutons de l’utilité de la lignée cellulaire de mECap18 comme un modèle approprié in vitro permettant d’étudier la régulation de l’activité sécrétrice épididymaire. À cette fin, nous décrivons les exigences de culture pour le maintien de la lignée cellulaire de mECap18 et de l’utilisation des schémas d’inhibition pharmacologique sélective qui sont capables d’influer sur leur profil de protéine sécrétoire. Ces derniers sont facilement évalués par le biais de la cueillette de milieu de culture conditionné, la concentration des protéines sécrétées par l’intermédiaire de précipitation de l’acide trichloroacétique et d’acétone et leur analyse ultérieure par SDS-PAGE et immunoblotting. Nous croyons que ces méthodes combinées sont adaptés pour l’analyse des protéines épididymaires autres cibles comme un prélude à déterminer leur rôle fonctionnel dans la maturation des spermatozoïdes et/ou de stockage.

Introduction

Les spermatozoïdes de toutes les espèces mammifères acquièrent la possibilité d’afficher la motilité progressive vers l’avant et de féconder un ovule durant leur descente prolongée par le biais de l’épididyme, une région hautement spécialisée du système conduit extra testiculaire mâle, qui peut prendre de 7 à 14 jours pour naviguer (selon les espèces)¹. En raison de l’extrême condensation de la chromatine paternelle et l’effusion de la majorité du cytoplasme qui accompagne la cytodifférenciation des spermatozoïdes dans les testicules, leur maturation fonctionnelle ultérieure est conduite exclusivement par leur interaction avec le microenvironne....