Målet med denne protokol er at give en trin for trin guide til at udføre 3-D “leveren-on-a-chip” infektion eksperimenter med hepatitis B-virus.
Trods den ekstraordinære smitteevne af hepatitis B virus (HBV) in vivo, hvor kun tre viral genomer kan resultere i en chronicity af eksperimentelt inficerede chimpanser, kræver mest in vitro-modeller flere hundreder til tusinder af viral genomer pr. celle i for at indlede en forbigående infektion. Derudover tillader statisk 2D kulturer af primære humane hepatocytter (PHH) kun kortsigtede undersøgelser på grund af deres hurtige dedifferentiation. Her beskriver vi 3D leveren-on-a-chip kulturer af PHH, enten i monokulturer eller i cocultures med andre nonparenchymal lever-resident celler. Disse tilbyder en betydelig forbedring af at studere langsigtede HBV infektioner med fysiologiske vært celle svar. Ud over at lette stof effekt undersøgelser, toksikologiske analyser og undersøgelser af patogenese, muliggøre disse mikrofluid kultur systemer evaluering af helbredende behandlinger for HBV infektion med henblik på at eliminere kovalent lukket, cirkulær (ccc) DNA. Dette præsenteret metode beskriver opsætning af PHH monokulturer og PHH/Kupffer Co cellekulturer, deres infektion med renset HBV og analyse af vært svar. Denne metode gælder især for vurdering af langtidsvirkningerne af HBV infektion, behandling kombinationer og patogenese.
Studiet af HBV er blevet kompliceret af den fattige modtagelighed for kultur systemer, der kræver flere hundreder til tusinder af HBV genom kopier pr. celle at indlede infektion1. Endvidere, primære humane hepatocytter er generelt yderst skrøbelige og dedifferentiate hurtigt under konventionelle kulturer2. Dette skyldes primært, at de flade og hård plast overflader ikke efterligne de naturlige ekstracellulære miljøer fundet inden for leveren og den generelle mangel på iltning af kulturer i mangel af mikrofluid omsætning. Konventionelle statisk hepatocyt kulturer på kollagen-belagte plader hurtigt dedifferentiate og mister deres følsomhed over for HBV infektion3. Her beskriver vi set-up og infektion af PHH vokset i 3D leveren-on-a-chip kulturer, som er meget fordelagtige over konventionel 2D statisk PHH kulturer på kollagen-belagte plader på grund af deres udvidede metaboliske og funktionel kompetence, lette langsigtet kulturer af mindst 40 dage4. I dette system, PHH seedede på kollagen-belagt stilladser, der er konstant perfunderet med vækstmedium til at levere ilt og næringsstoffer til cellerne. Selv om alternativ kultur systemer til PHH baseret på komplekse cocultures af murine fibroblaster eller 3D vækst i spheroids er blevet valideret og er modtagelige for HBV-infektion ved hjælp af multiplicities af infektion af 500 genom ækvivalenter (GE) af HBV pr celle, 3D leveren-on-a-chip kulturer forbliver den eneste in vitro-modelsystem modtagelige til 0,05 GE af HBV pr. celle4. Dette understøttet desuden af nødvendigheden af at bruge høje koncentrationer af dimethylsulfoxid (DMSO) og polyethylenglycol (PEG) for at etablere HBV infektion i disse kulturer, der er overflødige for infektion af 3D leveren-on-a-chip kultur systemer 4. blandt de store kendetegnende for HBV-infektion er cccDNA-pool, der fungerer som den transcriptional skabelon for alle de novo–produceret virioner5,6. Selv om cccDNA kan påvises i konventionelle hepatocyt kulturer7,8, det er fortsat uklart, om regulering af cccDNA og eventuelle terapeutiske tilgange med henblik på dens fjernelse er sammenfattet i delvis eller helt dedifferentiated hepatocytter. Vi har vist, at cccDNA er funktionelt dannet i 3D leveren-on-a-chip kulturer, reagerer på fysiologiske stimuli og kan rettes ved at blande sig med tilgængeligheden af det transkriptionel maskiner til cccDNA genom4.
Værten svar til HBV infektion i 3D leveren-on-a-chip efterligner dem observeret i HBV-inficerede patienter, muliggør identifikation af biomarkører for infektion, samt terapeutiske succes. Blandt de unikke funktioner i leveren-on-a-chip kulturer er evnen til at vurdere langsigtede vært svar mellem PHH og andre nonparenchymal celler i leveren, herunder Kupffer celler4, Stjernehus celler9og leveren sinusformet endotelceller10,11. Dette giver en unik mulighed for at evaluere celle/celle interaktioner i en kompleks 3D mikromiljø.
Derudover letter perioden udvidet kultur af denne platform evaluering af sekventielle lægemiddelsbehandlinger og deres indvirkning på HBV persistens, som ikke er muligt ved hjælp af konventionelle hepatocyt kultur systemer.
Denne protokol beskriver hvordan 3D leveren-on-a-chip kulturer er genereret, enten til monokulturer af PHH eller til cocultures af PHH med Kupffer celler. Derudover beskriver vi produktion af renset HBV for lav mangfoldighed af infektion undersøgelser, samt den efterfølgende analyse af værten og viral svar.
Udfordringer i at opretholde langsigtet kulturer af PHH har drevet udviklingen af flere kultur modeller med øget funktionalitet og levetid, hver udstiller differential fordele og ulemper. Det er nu almindeligt anerkendt, at statiske 2D kulturer af PHH efterligne visse aspekter af hepatocyt biologi for meget begrænsede mængder af tid. Således micropatterned cocultures12,13, klumpformet kulturer14,15, og 3D leveren-on-a-chip kulturer16,17 erstatter hurtigt disse mere grundlæggende systemer. Især når man studerer smitsomme sygdomme, som har coevolved med deres vært at udnytte specifikke microenvironments, er kravet om at give fysiologiske miljøer baseret på de ofte udfordrende karakter af dyrkning menneske-tropic smitsomme sygdomme, herunder hepatitis C virus, HBV og malaria.
Den mest kritiske trin i udførelsen af 3D leveren-on-a-chip kulturer er kvaliteten af de først indkøbte primære celletyper. Disse celler bør testes for deres overholdelse af kapacitet og kun plateable PHH masser bør anvendes for at sikre vellykket væv dannelse og kultur generation. Selvom frisk isolerede PHH kan bruges, deres kryopræservering er normalt kompliceret og kræver særlige sats-kontrollerede frysere.
I modsætning til konventionelle statisk 2D kulturer, vært genetiske baggrund er ubetydelig med hensyn til modtagelighed for HBV infektion, og alle dermed langt testede hepatocyt donorer er stand til at etablere HBV infektion4.
Selvom patienten-afledte HBV etablerer infektioner af 3D kulturer, er det nødvendigt at udnytte PIND-fældet og saccharose pude-renset HBV når som helst bruge inducerbar HBV producent celle linjer for generation af viral inocula. Celle kultur analysere direkte anvendes på 3D leveren-on-a-chip kulturer, enten gennem tilstedeværelsen af hæmmende faktorer eller på grund af inkompatibilitet nuværende vækstfaktorer med hepatocytter, medfører ikke let infektion. Desuden, når du vælger patient-afledte virale inocula, bør kun serum anvendes, da plasma uundgåeligt koagulerer og træsko mikrofluid omsætning af kultur-platformen.
Uanset den virale inokulum bruges, er sikre cellulære levedygtighed og differentiering, samt at sikre fuldstændig fjernelse af den oprindelige HBV inokulum, nøglen til vellykket langsigtet infektion undersøgelser. Den mest bekvemme måde at gøre dette er prøveudtagning kulturer efter fjernelse af den virale inokulum, samt måling af human serum albumin niveauer i hele perioden kultur. Bemærk, på samme måde for alle andre beskrevet platforme, HBV infektion, når etableret, spredes ikke let til ikke-inficerede celler. Den underliggende mekanisme for dette er fortsat undvigende, da HBV infektion in vivo let inficerer størstedelen af hepatocytter inden for leveren.
Med hensyn til cocultures af PHH og Kupffer celler er det tilrådeligt at udføre masse tests af Kupffer celler til at evaluere IL6 og TNFα sekretion i response på LPS stimulation, da ikke alle kommercielt tilgængelige Kupffer celledonorer har en lige lydhørhed.
Vigtigere, for alle medicinske behandlingsmetoder eller oprindelige infektion af kulturer med HBV, skal det samlede volumen af brønden (1,4 mL), samt for fra mikrofluid kanal (0,2 mL), tages i betragtning ved beregningen af narkotika eller inokulum koncentrationer. For at sikre korrekt dosering, er en vask skridt med medium indeholdende HBV eller narkotika udført for at prime mikrofluid kanalen.
Den anvendte platform udnytter 600.000 PHH pr. brønd, som sikrer flerlaget hepatocytter inden for stilladser. Selv om celle nummer kan varieres, sikrer den valgte celle koncentration optimale resultater. Formatet plade holder ialt 12 stilladser, som kan opgraderes til 36 stilladser. Men på grund af mikrofluid krav, skalere op til højere godt numre er ikke muligt at dato.
Brug af disse tilgange, kan kulturer opretholdes med optimal celle ydeevne i mindst 40 dage, som hidtil, giver hidtil usete muligheder for at evaluere nye lægemiddelkandidater, samt undersøge de komplekse samspil mellem forskellige hepatiske celle befolkninger under HBV infektion.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af en igangsætter tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd (637304), en Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), og af KN-Bio innovationer.
Reagents | |||
William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100X | GIBCO | 11140050 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
Trypan blue | Merck | T8154 | |
Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
G418 | SIGMA | G418-RO | |
Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
Sucrose | SIGMA | SO389 | |
Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
DAPI | SIGMA | D9564 | |
Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Kits/Consumables | |||
Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary cells / Cell lines | |||
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers/Probes/Standards | |||
HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
Manual torque | CN Bio innovations | ||
LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |