בידוד F1-ATPase מ פרוטיסטים טפילי Trypanosoma brucei
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של F1-ATPase משלב חרקים בתרבית של Trypanosoma brucei. ההליך מניב מורכב מאוד טהור, הומוגנית, פעיל מתאימים ללימודי אנזימטי מבניים.
Abstract
F1-ATPase הוא subcomplex קטליטי ממברנה-חיצוני של F-type ATP סינתאז, אנזים העושה את הכוח המניע של פרוטון מעבר ממברנות ביולוגיות לייצר אדנוזין טריפוספט (ATP). בידודו של ה-F שלם1-ATPase ממקור מקורי שלו הוא תנאי חיוני לאפיון של האנזים חלבון קומפוזיציה קינטית פרמטרים, רגישות מעכבי. מאוד טהור, הומוגניות F1-ATPase יכול לשמש ללימודים מבניים, אשר מספקים תובנה המנגנונים המולקולריים של סינתזת ATP, הידרוליזה. מאמר זה מתאר הליך של הטיהור של F1-ATPase מן Trypanosoma brucei, סוכן סיבתי של אפריקה trypanosomiases. ה F1-ATPase מנותקת שלפוחית מיטוכונדריאלי, אשר מתקבלים על ידי פירוק היפוטוניק של trypanosomes במבחנה תרבותי. השלפוחיות המוגלתיות הן מכנית מפוצל על ידי sonication ו ה נ1-ATPase הוא שוחרר מן קרום מיטוכונדריאלי הפנימי על ידי החילוץ כלורופורם. המתחם אנזימטי מטוהר עוד יותר על ידי exchange אניון רצופים ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. ספקטרומטר מסה רגיש טכניקות הראה כי המתחם מטוהרים נטול מזהמים כמעט כל חלבון, לכן, מייצג חומר מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-מיקרוסקופ. ה-F מבודד1-ATPase תערוכות פעילות hydrolytic ATP, אשר יכול להיות מעוכבים באופן מלא על ידי אזיד הנתרן, מעכב חזק של F-type ATP synthases. המתחם מטוהרים נשאר יציב ופעיל לפחות שלושה ימים בטמפרטורת החדר. משקעים על ידי אמוניום סולפט משמש לאחסון לטווח ארוך. נהלים דומים שימשו לטיהור של F1– ATPases רקמות מידע יונקים, שמרים או חיידקים. כך, הפרוטוקול שהוצגו יכול לשמש קו מנחה עבור ה F1-ATPase בידוד של אורגניזמים אחרים.
Introduction
Synthases F-type ATP הם מאוגד-ממברנה סיבוב קומפלקסים multiprotein רוברטסונית פרוטון זה זוג מעבר אנרגיה-transducing ממברנות של חיידקים, המיטוכונדריה מהכלורופלסט עם היווצרות של ATP. הפרטים מולקולרית של מנגנון סיבובי של סינתזת ATP ידועים בעיקר בשל לימודי המבנית של מטוהרים בקטריאליים ו מיטוכונדריאלי synthases ATP ושלהם subcomplexes1. F-type ATP סינתאז שמאורגנים moieties ממברנה-פנימי, חיצוני-ממברנה. החלק ממברנה-חיצוני, המכונה F1-ATPase, מכיל שלושה אתרים קטליטי, שבו מתרחשת זירחון של אדנוזין diphosphate (ADP) ATP או התגובה הפוכה. F1-ATPase יכול להשתחרר השפעול של moiety קרום-מהותי תוך שמירה על היכולת שלה hydrolyze, אבל לא לסנתז, ATP. המגזר מאוגד-ממברנה, שנקרא Fo, ומתווך רוברטסונית חלבון, אשר מניע את הסיבוב של החלק המרכזי של האנזים. F1 ו- Fo . סקטורים מחוברים באמצעות מרכזי והיקפי הגבעול.
הראשון מנסה לטהר את F1-ATPase ניצני שמרים, הלב שור המיטוכונדריה תאריך חזרה לשנות ה-60. פרוטוקולים אלה נעשה שימוש שחולצו המיטוכונדריה, אשר היו מובסים sonication, fractionated על ידי משקעים סולפט אמוניום או מה לעזאזל קרה, ואחריו כרומטוגרפיה אופציונלי step(s) וטיפול בחום2,3,4 5, ,6. הטיהור היה מאוד השתפר, פשוטה על ידי השימוש בכלורופורם, אשר משחרר בקלות את F1-ATPase מן קרום מיטוכונדריאלי שברים7. החילוץ כלורופורם שימש אז כדי לחלץ נ1– ATPases וממקורות שונים בעלי חיים, צמחים, חיידקי (למשל, עכברוש כבד8, תירס9, אראם maculatum10ו Escherichia coli 11). עוד טיהור של F שפורסמו כלורופורם1-ATPase מאת זיקה או גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) הניב חלבון טהור מאוד מורכבת, אשר היה מתאים מכשור לקביעת קשיות ומבנה ברזולוציה גבוהה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, כמו שתיעד את המבנים של F1-ATPase מן הלב שור12,13 ו האפייה14. F1-ATPase מבנים נקבעו גם של אורגניזמים שקשה לטפח, לפיכך, כמות החומר הביולוגי הראשוני היה מוגבל. במקרה זה, ה-F1-ATPase subunits היו באופן מלאכותי הביע ומצורפים המתחם ב e. coliוטיהרו האנזים heterologous כל היה מאת זיקה כרומטוגרפיה דרך של יחידת משנה מתויגות. גישה כזו הובילו הקביעה של F1-ATPase מבני שני המינים חיידקי לרום, Geobacillus stearothermophilus15 , Caldalkalibacillus thermarum16, 17. עם זאת, מתודולוגיה זו הוא מעדיף מצוייה F האיקריוטים1– ATPases מאז זה מסתמך על מכשיר prokaryotic protheosynthetic, עיבוד posttranslational, מכלול מורכבים.
החילוץ מבוססי כלורופורם השתמשת קודם לכן כדי לבודד F1– ATPases Trypanosoma cruziפרזיטים חד־תאיות digenetic18 ו brucei ט19, חשוב פתוגנים בתרבית של גורם אמריקאי ו Trypanosomiases אפריקאי, בהתאמה, ומתוך monogenic חרק טפיל Crithidia fasciculata20. Purifications אלה הובילו רק תיאור פשוט של ה F-1– ATPases, מכיוון שאין יישומים במורד הזרם שימשו לאפיין באופן מלא את הרכב, מבנה ומאפייני אנזימטי של המתחם. מאמר זה מתאר שיטה ממוטב עבור F1-ATPase טיהור מהבמה מחזור חיי חרק בתרבית של brucei טי. השיטה מפותח בהתבסס על הפרוטוקולים הוקמה עבור בידוד של שור ושמרים F1– ATPases21,22. ההליך התשואות מאוד טהור, הומוגניות אנזים מתאים במבחנה אנזימטי או מעכבות מבחני, אפיון מפורט פרוטיאומיה מבנית באמצעות ספקטרומטר מסה23, קביעת מבנה24. פרוטוקול טיהור ואת הידע של F1-ATPase מבנה בשלב האטומי פותח אפשרות לעצב מסכים כדי לזהות מעכבי מולקולה קטנה, וסיוע בפיתוח של תרופות חדשות נגד trypanosomiases אפריקה. יתר על כן, הפרוטוקול ניתן להתאים לטהר F1-ATPase של אורגניזמים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול עבור F1-ATPase טיהור מ ט brucei פותחה על בסיס שיטות שפורסמו קודם לכן עבור בידודו של F1-ATPase קומפלקסים של מינים אחרים,13,14. השיטה אינה דורשת כל שינוי גנטי (למשל, תיוג) ותשואות מתחם פעיל מלא עם כל subunits הנוכחי. צעד קריטי הוא שחרור הקלו כלורופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי משרד החינוך ERC CZ הענק LL1205, המענק גרנט סוכנות של צ’כיה 18-17529S, ולא על ידי ERDF/ESF פרויקט מרכז לחקר פתוגניות, התקפה אלימה של טפילים (מס ‘ CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
- Walker, J. E., Wikström, M. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).
- Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
- Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
- Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
- Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
- Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
- Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
- Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
- Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
- Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
- Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
- Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
- Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
- Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
- Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
- Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
- Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
- Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
- Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
- Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
- Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
- Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
- Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
- Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
- Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
- Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
- Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
- Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
- Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).
