F1의 절연-ATPase 기생 원생 생물 Trypanosoma brucei 에서

요약

이 프로토콜 설명 F₁의 정화- Trypanosoma brucei의 교양된 곤충 단계에서 ATPase. 프로시저 생성 매우 순수한, 균질, 고 활성 복잡 한 구조상과 효소 연구에 적합 합니다.

초록

F₁-ATPase는 F 형 ATP synthase, 생물 막에 걸쳐 양성자 동기 힘을 사용 하 여 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 생산 하는 효소의 막 외부 촉매 subcomplex. 그대로 F₁의 절연-ATPase는 네이티브 소스에서 효소의 단백질 구성, 운동, 변수와 감도 억제제를 특성화 하는 필수적인 전제 조건입니다. 매우 순수 하 고 균질 F₁-ATPase는 ATP 합성과 가수분해의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 구조 연구에 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 설명 합니다 F₁의 정화에 대 한 절차- Trypanosoma brucei, 아프리카 trypanosomiases의 원인이 되는 대리인에서에서 ATPase. F₁-ATPase는 침투성 세포에 생체 외에서 배양 trypanosomes에서 여는 미토 콘 드 리아 vesicles에서 격리 됩니다. 소포는 기계적으로 쥡니다와 F₁에 의해 조각-ATPase는 클로 프롬 적 출에 의해 내부 미토 콘 드 리아 멤브레인에서 발표. 효소 복합물은 추가 연속 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정화 된다. 중요 한 질량 분석 기술을 보여주었다는 순화 된 복잡 한 거의 모든 단백질 오염 물질 없는 이며, 따라서, 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법에 의해 구조 결심을 위한 적당 한 물자를 나타냅니다. 격리 된 F₁-ATPase 전시 ATP 가수분해 활동, 나트륨 아 지 드, F 형 ATP synthases의 강력한 억제제에 의해 완전히 저해 될 수 있습니다. 순화 된 복잡 한 실내 온도에 적어도 3 일에 대 한 안정적이 고 활성 남아 있습니다. 황산 암모늄에 의해 강 수는 장기 저장을 위해 사용 됩니다. 유사한 절차는 F₁의 정화 사용 되었습니다-ATPases 포유류 및 식물 조직, 효 모, 또는 박테리아. 따라서, 제시 프로토콜 F₁에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase 격리.

서론

F 타입 ATP synthases는 막 도약 ATP 형성 박테리아와 미토 콘 드리 아, 엽록체의 에너지 시험 막 걸쳐 multiprotein 단지 그 몇 양성자 전 좌를 회전. ATP 합성의 회전 메커니즘의 분자 세부 정화 박테리아와 미토 콘 드리 아 ATP synthases 및 그들의 subcomplexes¹의 구조 연구 때문에 주로 알려져 있습니다. F 형 ATP synthase 막 내장 고 막 외부 moieties로 구성 됩니다. F₁막 외부 부분-ATPase, 포함 ATP 또는 역방향 반응은 아데노신 diphosphate (ADP)의 인 산화 발생 3 촉매 사이트. F₁-ATPase 공개 될 수 있는 실험적으로 막 내장 moiety에서은, 하지만 하지, ATP를 합성 하는 기능을 유지 하면서. F_o, 라고 막 도약 분야 중재 단백질 전 좌, 효소의 중앙 부분의 회전 드라이브. F₁ 과 F_o 분야 중앙과 주변 줄기로 연결 된다.

첫 번째는 F₁을 정화 하려고-1960 년대에 다시 싹 트는 효 모 및 소 심장 미토 콘 드리 아에서 ATPase. 이러한 프로토콜 사용 추출 쥡니다, ....

프로토콜

1. 버퍼 및 솔루션

1. 아래에 나열 된 솔루션을 준비 합니다. 액체 크로마토그래피에 대 한 모든 버퍼 드 그냥 사용 하기 전에 ADP, benzamidine, 및 프로 테아 제 억제제를 추가 합니다.
   1. Aminocaproic 산 (ACA), 그리고 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 염 산 (Tris HCl) ph 8.0, 0.25 M 자당 5 m m benzamidine, 5mm 버퍼 a: 50 mM Tris 버퍼를 준비 합니다.
   2. 버퍼 b: 50 mM Tris HCl pH 8.0, 0.25 M 자당, 4 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 5mm benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP, 및 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A)를 준비 합니다.
   3. Q 열 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10mm MgSO₄, 5 mM ben....

결과

일반적인 정화 (그림 1) T. brucei 셀²⁵ 표준에서 양식 2 x 10¹¹ procyclic hypotonically lysed 1 x 10¹¹ Percoll 그라데이션에 고립 된 미토 콘 드 리아 소포 (mitoplasts)로 시작 포도 당-풍부한 SDM-79 중²⁷. mitoplasts 쥡니다, 돌 다에 의해 조각화 되 고 포함 하는 매트릭스 상쾌한 삭제 됩니다. 미토 콘 드리 아 막 클로 프롬 F₁을 출시와 함께 처리 됩니다-ATPase. 원심, 후 유기 단계 및 침전 된 interphase는 삭제 됩니다. 수성 단계는 분류 한 4 급 암모늄, 강한 음이온 교환기 (그림 2A)에 이온-교환 크로.......

토론

F₁에 대 한 프로토콜-ATPase 정화 T. brucei 에서 개발한 F₁의 분리에 따라 이전에 게시 방법-ATPase 단지 다른 종^13,14에서. 메서드에 유전 수정 필요 하지 않습니다 (예를 들어, 태그) 하 고 현재 모든 소 단위와 완전히 활성화 단지 생성. 중요 한 단계는 F₁의 클로 프롬 촉진 릴리스-ATPase 효소의 막 연결 부분에서. 지금까지 설명 된 모든 진 핵 종에서 purifications, 출시 subcomplex subunits α, β, γ, δ, 및 3:3:1:1:1의 산출할에서 ε 포함 되어 있습니다. T. brucei, F₁에서-ATPase 소 단위 p18, euglenozoan 원생²³제한 소설 구성의 3 개의 복사본을 추가.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)	Applichem	A0948
Amastatin Hydrochloride	Glantham Life Sciences	GA1330
Aminocaproic Acid	Applichem	A2266
BCA 단백질 분석 키트	ThermoFischer Scientific/Pierce	23225
Benzamidine Hydrochloride	Calbiochem	199001
Bestatin Hydrochloride	Sigma Aldrich/Merck	B8385
클로로포름	모든 공급업체
cOmplete 정제, Mini EDTA 무함유	Roche	4693159001	프로테아제 억제제 칵테일 정제
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any supplier
염산	pH 조정을 위한	모든 공급업체
Ile-Pro-Ile	시그마 Aldrich/Merck	I9759	별칭 Diprotin A
Leupeptin	Sigma Aldrich/Merck	L2884
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트	모든 공급업체
펩스타틴 A	시그마 Aldrich/Merck	P5318
단백질 전기 영동 시스템	모든 공급 업체
염화나트륨	모든 공급 업체
설탕	모든 공급 업체
Tris	모든 공급 업체
< 강한> 이름 < / 강한>	< 강한> 회사 < / 강>	< 강한>카탈로그 번호 < / strong>	Comments< / strong>
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