Isolation de F1-ATPase de la protiste parasite Trypanosoma brucei
Summary
Ce protocole décrit la purification de la F1-ATPase de la scène des insecte de Trypanosoma brucei. La procédure donne un complexe très pur, homogène et actif adapté aux études structurales et enzymatiques.
Abstract
F1-ATPase est un complexe catalytique membrane extrinsèques de type F ATP synthase, une enzyme qui utilise la force motrice de proton à travers les membranes biologiques pour produire de l’adénosine triphosphate (ATP). L’isolement de l’intact F1-ATPase de sa source native est une condition essentielle pour caractériser la composition en protéines, les paramètres cinétiques et sensibilité aux inhibiteurs de l’enzyme. Un très pure et homogène F1-ATPase peut être utilisé pour les études structurales, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la synthèse d’ATP et d’hydrolyse. Cet article décrit une procédure pour la purification de la F1-ATPase de Trypanosoma brucei, l’agent causal des trypanosomiases africaines. La F1-ATPase est isolée des vésicules mitochondriales, qui sont obtenus par lyse hypotonique de in vitro cultivée trypanosomes. Les vésicules sont mécaniquement fragmentées par sonication et le F1-ATPase est libéré de la membrane mitochondriale interne par l’extraction au chloroforme. Le complexe enzymatique est ensuite purifié par échange d’anions consécutives et chromatographie d’exclusion stérique. Techniques de spectrométrie de masse sensible montrent que le complexe purifié est dépourvue de pratiquement tout contaminant de protéine et représente donc un matériau approprié pour la détermination de la structure par diffraction des rayons x ou cryo-microscopie électronique. L’isolé F1-ATPase présente une activité hydrolytique ATP, qui peut être inhibée totalement de l’azide de sodium, un puissant inhibiteur de type F ATP synthases. Le complexe purifié reste stable et actif pendant au moins trois jours à température ambiante. Précipitation de sulfate d’ammonium est utilisée pour le stockage à long terme. Des procédures similaires ont été utilisées pour la purification de F1– ATPases de tissus de mammifères et de plantes, de levures ou de bactéries. Ainsi, le protocole présenté peut servir de modèle pour la F1-isolement ATPase provenant d’autres organismes.
Introduction
Les type F ATP synthases sont membranaires tournantes complexes multiprotéiques que la translocation de protons couple à travers les membranes transduction de l’énergie des bactéries, des mitochondries et chloroplastes avec la formation d’ATP. Les détails moléculaires du mécanisme de rotation de la synthèse d’ATP sont connus principalement en raison des études structurales de purifiée bactérienne et mitochondrial ATP synthases et leurs subcomplexes1. F-type ATP synthase est organisé dans les fractions membranaires intrinsèques et extrinsèques à la membrane. La partie membranaire-extrinsèque, appelée F1-ATPase, contient trois sites catalytiques, où la phosphorylation de l’adénosine diphosphate (ADP) à ATP ou la réaction inverse se produit. F1-ATPase peut être libéré expérimentalement la portion membranaires intrinsèques tout en conservant sa capacité à hydrolyser, mais pas synthétiser, ATP. Le secteur de membrane-bondissent, dénommé Fo, intervient dans la translocation de la protéine, qui entraîne la rotation de la partie centrale de l’enzyme. Les secteurs deo F et de F1 sont reliés par des tiges centrales et périphériques.
La première tente de purifier le F1-ATPase de la levure de bière et de la date de mitochondries de coeur de boeuf vers les années 1960. Ces protocoles utilisés extraites des mitochondries, qui ont été perturbées par la sonication, fractionnée par précipitation au sulfate d’ammonium ou de protamine, suivie par chromatographie facultatif étapes et traitement thermique2,3,4 ,5,6. La purification a été grandement améliorée et simplifiée par l’utilisation du chloroforme, qui libère facilement le F1-ATPase de la membrane mitochondriale des fragments7. L’extraction de chloroforme a ensuite été utilisée pour extraire des F1– ATPases de divers animaux, végétaux et des sources bactériennes (p. ex., foie de rat8, maïs9, Arum maculatum10et Escherichia coli 11). Outre la purification du chloroforme-sortie F1-ATPase par chromatographie d’affinité ou exclusion stérique (SEC) a produit une protéine pure hautement complexe, qui convenait pour la détermination de la structure à haute résolution par cristallographie aux rayons x, comme documenté par les structures de F1-ATPase de coeur bovine12,13 et14de la Saccharomyces cerevisiae. F1-ATPase structures ont été également déterminées d’organismes qui sont difficiles à cultiver et, par conséquent, la quantité de la matière biologique initiale était limitée. Dans ce cas, le F1-ATPase sous-unités ont été artificiellement exprimées et assemblées dans le complexe chez e. coli, et l’ensemble hétérologue enzyme a été purifiée par affinité Chromatographie via une sous-unité étiquetée. Cette approche a conduit à la détermination de F1-structures de l’ATPase de deux espèces de bactéries thermophiles, Geobacillus stearothermophilus15 et thermarum Caldalkalibacillus16, 17. Toutefois, cette méthode est plutôt impropre à eucaryotes F1– ATPases puisqu’elle s’appuie sur l’appareil protheosynthetic procaryote, transformation post-traductionnelle et assemblage complexe.
L’extraction axée sur le chloroforme a été précédemment utilisée pour isoler F1– ATPases de digène unicellulaires parasites Trypanosoma cruzi18 et T. brucei19, importants pathogènes chez les mammifères d’Amérique et Les trypanosomiases africaines, respectivement et de monogénique insecte parasite Crithidia fasciculata20. Ces purifications conduit seulement à une simple description de la F1– ATPases, puisqu’aucune demande en aval ont été utilisées pour caractériser complètement la composition, structure et propriétés enzymatiques du complexe. Cet article décrit une méthode optimisée pour F1-purification de l’ATPase de l’étape de cycle de vie insectes cultivées de T. brucei. La méthode est élaborée selon les protocoles établis pour l’isolement de bovins et la levure F1– ATPases21,22. La procédure donne très pure et homogène enzyme appropriée pour in vitro enzymatiques et inhibiteur des dosages, protéomiques détaillées caractérisation par spectrométrie de masse23et de détermination de structure24. Le protocole de purification et de la connaissance de la F1-structure de l’ATPase au niveau atomique ouvre une possibilité pour la conception d’écrans pour identifier les inhibiteurs de petites molécules et aider au développement de nouveaux médicaments contre les trypanosomiases africaines. En outre, le protocole peut être adapté pour purifier F1-ATPase provenant d’autres organismes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole pour F1-purification de l’ATPase de T. brucei a été développé sur la base des méthodes publiées antérieurement pour l’isolement des F1-complexes de l’ATPase d’autres espèces13,14. La méthode ne requiert pas une modification génétique (p. ex., marquage) et conduit un complexe actif complet avec toutes les sous-unités présents. L’étape cruciale est la libération de chloroforme-facilité d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le ministère de l’éducation ERC CZ accorder LL1205, l’octroi de subvention Agence de la République tchèque 18-17529S et par FEDER/FSE du projet Centre de recherche de la pathogénicité et la virulence des parasites (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
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