Isolierung der F1-ATPase aus der parasitären protiste Trypanosomen Trypanosomen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung des F-1-ATPase aus dem kultivierten Insekt Stadium der Trypanosomen Trypanosomen. Das Verfahren ergibt einen sehr reinen, homogen und aktive Komplex für strukturelle und enzymatische Studien geeignet.
Abstract
F1-ATPase ist ein Membran-extrinsische katalytische Subcomplex von F-Typ-ATP-Synthase, ein Enzym, das die Proton Motor über Biologische Membranen verwendet, um Adenosintriphosphat (ATP) zu produzieren. Die Isolation der intakten F1-ATPase native entspringt ist eine wesentliche Voraussetzung für des Enzyms Proteinzusammensetzung, kinetische Parameter und Sensibilität für Inhibitoren zu charakterisieren. Ein hochreines, homogene F1-ATPase eignet sich für strukturelle Studien, die Einblick in die molekularen Mechanismen der ATP-Synthese und Hydrolyse. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von der F-1-ATPase aus Trypanosomen Trypanosomen, die Erreger der afrikanischen Trypanosomiases. Die F-1-ATPase ist isoliert von mitochondrialen Vesikel, die durch hypotone lyse von in Vitro kultivierten Trypanosomen gewonnen werden. Die Vesikel sind mechanisch fragmentiert, Beschallung und der F-1-ATPase ist durch die Chloroform-Extraktion aus der inneren mitochondrialen Membran befreit. Der enzymatische Komplex wird weiter durch aufeinanderfolgende Anion Austausch und Größe-Ausschluss Chromatographie gereinigt. Sensible Massenspektrometrie Techniken zeigte, dass die gereinigte Anlage frei von nahezu jedem Protein Verunreinigungen ist und daher, geeignetes Material zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie stellt. Die isolierte F1-ATPase Exponate ATP hydrolytische Aktivität, die voll von Natriumazid, ein potenter Inhibitor der F-Typ-ATP-Synthasen gehemmt werden kann. Die gereinigte Anlage bleibt stabil und aktiv für mindestens drei Tage bei Zimmertemperatur. Niederschlag von Ammoniumsulfat wird für die langfristige Lagerung verwendet. Ähnliche Verfahren werden für die Reinigung von F1– ATPasen aus Säugetieren und pflanzlichen Geweben, Hefen oder Bakterien. So kann die vorgestellte Protokoll dienen als Richtschnur für die F-1-ATPase isoliert von anderen Organismen.
Introduction
Die F-Typ-ATP-Synthasen sind Membrane-springen rotierende Multi-komplexe, dass paar Protonen-Translokation über Energie-transducing Membranen von Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit der Bildung von ATP. Molekularen Details des rotierenden Mechanismus der ATP-Synthese sind vor allem wegen der strukturellen Studien des gereinigten Bakterien- und mitochondrialen ATP-Synthasen und ihre Subcomplexes1bekannt. F-Typ-ATP-Synthase ist in Membran-intrinsische und extrinsische Membran Moieties unterteilt. Der Membran-extrinsische Teil, bekannt als F-1-ATPase, enthält drei katalytischen Standorte, wo die Phosphorylierung des Adenosin-diphosphat (ADP), ATP oder die umgekehrte Reaktion auftritt. F1-ATPase kann unter Beibehaltung seiner Fähigkeit, Hydrolyseneigung, aber nicht synthetisieren ATP experimentell aus der Membran-intrinsische glyko-freigesetzt werden. Die Membrane-springen-Sektor, genannt Fo, vermittelt Protein Translokation, die die Drehung des zentralen Teils des Enzyms antreibt. F1 und Fo Sektoren sind durch die zentrale und periphere Stiele verbunden.
Die ersten Versuche, die F-1zu reinigen-ATPase aus angehenden Hefe und Rinder Herz Mitochondrien Datum zurück bis in die 1960er Jahre. Diese Protokolle verwendet extrahiert Mitochondrien, die durch Ultraschallbehandlung, fraktioniert durch Ammonium oder Protamin Sulfat-Fällung, gefolgt von optionalen Chromatographie Schritte und Wärmebehandlung2,3,4 gestört wurden ,5,6. Die Reinigung wurde stark verbessert und vereinfacht durch die Verwendung von Chloroform, die bereitwillig die F-1frei-ATPase aus der mitochondrialen Membran Fragmente7. Die Chloroform-Extraktion wurde dann zur F1Auszug – ATPasen aus verschiedenen Tier-, Pflanzen- und bakteriellen Quellen (z.B., Ratte Leber8Mais9, Arum Maculatum10und Escherichia coli 11). Weitere Reinigung des Chloroform veröffentlicht F1-ATPase durch Affinität oder Größe-Exclusion Chromatography (SEC) ergab eine hochreine Proteinkomplex, der für hochauflösende Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie geeignet war, als dokumentiert von den Strukturen des F-1-ATPase aus bovine Herz12,13 und Saccharomyces Cerevisiae14. F1-ATPase Strukturen wurden auch von Organismen, die schwierig zu kultivieren sind bestimmt und somit beschränkte sich des Betrags des ursprünglichen biologischen Materials. In diesem Fall, die F-1-ATPase Untereinheiten wurden künstlich zum Ausdruck gebracht und montiert in den Komplex in E. Coli, und das ganze heterologe Enzym durch Affinität Chromatographie über einen tagged Untereinheit gereinigt wurde. Dieser Ansatz führte zu die Bestimmung des F-1-ATPase Strukturen aus zwei thermophile Bakterien-Spezies, Geobacillus Stearothermophilus15 und Caldalkalibacillus Thermarum16, 17. diese Methode ist jedoch eher ungeeignet für eukaryotische F1– ATPasen da es stützt sich auf die prokaryotische Protheosynthetic Apparat, posttranslationale Verarbeitung und aufwändige Montage.
Die Chloroform-basierte Extraktion war früher F1isolieren – ATPasen aus einzelligen Digenetic Parasiten Trypanosoma Trypanosomen18 und T. Trypanosomen19, wichtigen Säugetieren Krankheitserreger verursacht amerikanische und Afrikanische Trypanosomiases bzw. monogenen Insekten Parasiten Crithidia Fasciculata20. Diese Reinigungen führte nur eine einfache Beschreibung des F-1– ATPasen, da keine downstream-Anwendungen verwendet wurden, um vollständig zu charakterisieren, die Zusammensetzung, Struktur und enzymatischen Eigenschaften des Komplexes. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Methode für F1-ATPase Reinigung von der kultivierten Insekt Lebenszyklus von T. Trypanosomen. Die Methode ist basiert auf die etablierte Protokolle zur Isolation von Rindern und Hefe F1– ATPasen21,22entwickelt. Das Verfahren liefert sehr reine und homogene Enzym geeignet für in-vitro- enzymatische und hemmenden Assays, detaillierte Proteomic Charakterisierung durch Massenspektrometrie23und Struktur Entschlossenheit24. Die Reinigung-Protokoll und das Wissen um die F-1-ATPase-Struktur auf atomarer Ebene öffnet eine Möglichkeit zur Gestaltung von Bildschirme zu identifizieren Small-Molecule-Inhibitoren und Hilfe bei der Entwicklung neuer Medikamente gegen afrikanische Trypanosomiases. Darüber hinaus lässt sich das Protokoll anpassen, F1zu reinigen-ATPase aus anderen Organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll für F1-ATPase Reinigung von T. Trypanosomen wurde entwickelt, basierende auf zuvor veröffentlichte Methoden für die Isolierung von F1-ATPase komplexe aus anderen Arten13,14. Die Methode erfordert keine genetische Änderungen (z. B.tagging) und ergibt einen vollaktiven Komplex mit allen Untereinheiten vorhanden. Der entscheidende Schritt ist die Chloroform erleichterte Version von F-1-ATPase aus d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde gefördert durch das Ministerium für Bildung ERC CZ gewähren LL1205, Grant Agency Tschechien Grant 18-17529S, und vom EFRE/ESF Projekt Zentrum für die Erforschung der Pathogenität und Virulenz des Parasiten (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).
Materials
| Chemicals | |||
| Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
| Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
| Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
| BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
| Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
| Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
| Chloroform | Any supplier | ||
| cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
| Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
| Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
| Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
| Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
| Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
| Sodium Chloride | Any supplier | ||
| Sucrose | Any supplier | ||
| Tris | Any supplier | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
| DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
| Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
| HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
| Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
| Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
| Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
| Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
| Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |
References
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