वीवो में नवजात चूहों में Cortical न्यूरॉन्स की दो-फोटॉन इमेजिंग
Summary
हम इमेजिंग के लिए एक vivo दो फोटॉन इमेजिंग प्रोटोकॉल में मौजूद नवजात चूहों के मस्तिष्क प्रांतस्था । इस विधि cortical ंयूरॉंस की विकासात्मक गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है, आणविक तंत्र है कि नियंत्रण के न्यूरॉन गतिशीलता, और रोग मॉडलों में न्यूरॉन गतिशीलता में परिवर्तन.
Abstract
दो-फोटॉन इमेजिंग में vivo विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है स्तनधारी मस्तिष्क में न्यूरॉन सर्किट. हालांकि, vivo इमेजिंग तरीकों में से एक सीमित संख्या में जीवित नवजात स्तनधारियों के मस्तिष्क ऊतक की जांच के लिए मौजूद हैं । साथ ही हम नवजात चूहों रहने में इमेजिंग व्यक्तिगत cortical ंयूरॉंस के लिए एक प्रोटोकॉल संक्षेप । इस प्रोटोकॉल में निंनलिखित दो तरीके शामिल हैं: (1) विकासशील मस्तिष्क में विरल और cortical न्यूरॉन्स के उज्ज्वल लेबलिंग के लिए सुपरनोवा प्रणाली, और (2) नाजुक नवजात खोपड़ी के लिए एक शल्य प्रक्रिया । इस प्रोटोकॉल एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ नवजात चरणों के दौरान व्यक्तिगत cortical neurites के लौकिक परिवर्तन के अवलोकन की अनुमति देता है । लेबल सेल विशिष्ट जीन मुंह बंद करने और नॉकआउट भी आरएनए हस्तक्षेप और CRISPR/Cas9 जीन संपादन प्रणालियों के साथ सुपरनोवा के संयोजन के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल कर सकते हैं, इस प्रकार, cortical ंयूरॉंस की विकासात्मक गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, आणविक तंत्र है कि नियंत्रण के न्यूरॉन गतिशीलता, और रोग मॉडल में न्यूरॉन गतिशीलता में परिवर्तन.
Introduction
सेरेब्रल प्रांतस्था में न्यूरॉन सर्किट की सटीक तारों धारणा, अनुभूति सहित उच्च मस्तिष्क कार्यों के लिए आवश्यक है, और सीखने और स्मृति. Cortical सर्किट गतिशील जन्मोत्तर विकास के दौरान परिष्कृत कर रहे हैं । अध्ययनों ने ऊतकवैज्ञानिक का उपयोग करते हुए cortical सर्किट गठन की प्रक्रिया की जांच की है और इन विट्रो संस्कृति का विश्लेषण किया है । हालांकि, रहने वाले स्तनधारियों में सर्किट गठन की गतिशीलता ज्यादातर बेरोज़गार बनी हुई है ।
दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से वयस्क माउस मस्तिष्क1,2में न्यूरॉन सर्किट के vivo विश्लेषण में के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, तकनीकी चुनौतियों के कारण, केवल अध्ययनों की एक सीमित संख्या नवजात चूहों में न्यूरॉन सर्किट गठन को संबोधित किया है. उदाहरण के लिए, Carrillo एट अल. सेरिबैलम में दूसरे जन्मोत्तर सप्ताह3में फाइबर चढ़ाई के समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन किया । Portera-Cailliau एट अल. पहले जन्मोत्तर4सप्ताह में cortical परत 1 में axons के इमेजिंग की सूचना दी । वर्तमान अध्ययन में, हम 4 cortical न्यूरॉन्स और नवजात चूहों में उनके dendrites परत के अवलोकन के लिए एक प्रोटोकॉल संक्षेप. इस प्रोटोकॉल है, जो दो के तरीके में शामिल है, आवेदन द्वारा प्राप्त परिणाम हमारे हाल ही में5प्रकाशन में सूचित कर रहे हैं । सबसे पहले, हम सुपरनोवा वेक्टर प्रणाली5,6 नवजात मस्तिष्क में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स लेबलिंग के लिए का उपयोग करें । सुपरनोवा प्रणाली में, फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए इस्तेमाल कर रहे है और विनिमय करने वाले सेल विशिष्ट जीन पछाड़ना और संपादन/पीटकर विश्लेषण भी संभव है । दूसरा, हम नाजुक नवजात चूहों में कपाल खिड़की तैयारी के लिए एक शल्य प्रक्रिया का वर्णन । साथ में, इन तरीकों के नवजात दिमाग में व्यक्तिगत ंयूरॉंस की vivo प्रेक्षण में अनुमति देते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल और समस्या निवारण में महत्वपूर्ण चरण:
प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम खोपड़ी (प्रोटोकॉल चरण ३.२) को हटाने की है । प्रविष्टि पर, उस्तरा ब्लेड अक्सर बाडी का पालन करता है, ड्युल खून बह र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने अपनी तकनीकी सहायता के लिए टी. सातो, एम. Kanbayashi, और एस Kouyama का शुक्रिया अदा किया । यह काम JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP15K14322 और JP16H06143, टाकेडा विज्ञान फाउंडेशन, उएहारा मेमोरियल फाउंडेशन, और नीगाटा विश्वविद्यालय ब्रेन रिसर्च इंस्टीट्यूट 2017-2923 (H.M.) के सहयोगी अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था और द्वारा KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, और JP15H04263 और अनुदान नवाचार क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान में “स्क्रैप और निर्माण प्रणाली द्वारा मस्तिष्क समारोह के गतिशील विनियमन” (JP16H06459) से MEXT (तिवारी) ।
Materials
| pK031. TRE-Cre | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from RIKEN BRC and Addgene |
| pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE | Authors | – | Available from authors |
| Isoflurane | Wako | 099-06571 | |
| 410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine) | Univentor | 8323101 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 084-1469SB | |
| MµltiFlex Round (loading tip) | Sorenson | 13810 | |
| Gelfoam (gelatin sponge) | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Agarose | Sigma | A9793 | Low melting point |
| Round-shaped coverslip | Matsunami | – | Custom made |
| Unifast 2 (dental cement) | GC | – | |
| Titanium bar | Authors | – | Custom made (see Figure 1G) |
| Rimadyl (carprofen) | Zoetis | – | Injectable |
| 2-photon microscope | Zeiss | LSM7MP | |
| Titanium-sapphire laser | Spertra-Physics | Mai-Tai eHPDS | |
| Titanium plate | Authors | – | Custom made (see Figure 2A) |
| IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro | BITPLANE | ||
| Goniometer stage | Thorlabs | GN2/M |
References
- Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
- Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
- Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
- Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
- Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
- Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).
