Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
Doku hücreleri elektriksel aktivitesinin elektrofizyolojik teknikleri tarafından izlenebilir ama bunlar genellikle tek tek hücreler analiz için sınırlıdır. Hücre içi kalsiyum (Ca2 +) sitozol artış kez elektriksel aktivite nedeniyle oluşur veya sayısız diğer uyaranlara yanıt olarak, bu işlem tarafından izlenebilir sonra hücreleri görüntüleme florasan kalsiyum duyarlı ile yüklü boyalar. Ancak, bu boyalar doku içinde tüm hücre tipleri tarafından alınır çünkü bu yanıtı tüm doku içinde bireysel bir hücreye görüntü zordur. Buna ek olarak, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (turk) bir tek hücre türüne göre ifade edilebilir ve böylece tüm nüfus içinde sinyal Ca2 + görüntüleme erişimine izin verme intrasellüler Ca2 +, artış yanıt olarak belli tek hücre türleri. Burada, biz turk GCaMP3/6 Kullanım fare nöromüsküler kavşak uygulamak, motor nöronlar, iskelet kası ve terminal/perisynaptic arasında üçlü bir synapse Schwann hücreleri. Biz bu teknik klasik ex vivo doku müstahzarları yarar göstermek. Bir optik bölücü kullanarak, biz çift dalga boyu görüntüleme dinamik Ca2 + sinyal ve nöromüsküler kavşak (NMJ) statik bir etiket iki hücre özgü GECI veya genetik olarak kodlanmış gerilim izlemek için kolayca adapte olabilir bir yaklaşım yerine Göstergeler (GEVI) aynı anda. Son olarak, biz floresan yoğunluğu uzamsal haritalar yakalamak için kullanılan yordamları tartışıyorlar. Birlikte, bu optik, transgenik ve analitik teknikler farklı hücre altgrupları çeşitli bağlamlarda NMJ, biyolojik aktivitesini incelemek için istihdam edilebilir.
Giriş
Gibi tüm sinapslarda, NMJ üç unsurdan oluşur: presynaptic bir terminal türetilmiş bir nöron, bir postsinaptik nöron/efektör hücre ve bir perisynaptic gliyal hücre1,2. Sinaptik iletimi temel yönlerini ilk bu synapse3' te gösterilen, birçok açıdan, bu işlemin kısmen nedeniyle bu synapse farklı hücresel elementlerin tarafından aynı moleküllerden ifadesi bilinmeyen kalır. Örneğin, omurgalı NMJ, motor nöronlar tarafından ortak yayımlanan, reseptörleri pürin adenin nükleotit ATP ve asetilkolin (ACh), kas, Schwann hücreleri ve motor nöronlar, böylece herhangi bir yorumu karmaşık hale getiren t....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvancılık ve deneyler için bakım ve kullanım laboratuvar hayvan ve IACUC University of Nevada, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak yapıldı.
1. zarlar ve frenik sinir transgenik fareler üzerinden hazırlanması
- Transgenik fareler ve oligonükleotid astar genotip için bu fare satın alabilirsiniz.
Not: Astar her bu fareler için "Bilgi" sayfasında listelenir.- 3 - için 6-ay-yaşlı fare uygun transgenik/knock-in Cre-sürücü alleli bir kopyasını ve sıfır koşullu GCaMP3/6 gen kopyalarını koşullu GCaMP3 bir veya iki kopyasını ifade aynı yaş ikinci bir fare ile ifade etmek üreme / 6 alleli ve Cre-sürücü ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Çeşitli değişikliklere örnek olarak artar olan intrasellüler Ca2 + NMJ türleri tanımlanmış hücre içinde tarafından aracılı floresan yoğunluğu, belgili tanımlık yarar bu yaklaşımın göster. Bu sonuçlar yanıt veren hücrelerin konumunu, hem de böylece kaç hücre yanıt ve ne kadar her hücre için belirli bir yanıt değerlendirilmesi için izin verdikleri yanıtlara yoğunluğunu sağlamak kayma floresan yoğunluğu haritalar olarak sunulur uyarıcı. Örneğin, Şekil 1
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada biz Ca2 + yanıt sağlam nöromüsküler doku GECI ifade fare kullanarak belirli hücrelerde ölçme bazı örnekler sağlar. Bu deneyler başarıyla gerçekleştirebilmek sırasında diseksiyon frenik sinir incitmek değil zorunludur. CA2 + Schwann hücreleri (Örneğin, 20 X veya 60 X) düşük veya yüksek güçte yanıtlarında görüntüye, ya BHC ya da µ-conotoxin blok hareket için kullanmak gereklidir. Düşük güç görüntüleme için tepkilerin Ca2 + kas hücreleri, onları böylece uzunluğu değişiklikler.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Bu eser fonları sağlık (NIH) GM103554 ve GM110767 (T.W.G.) için ulusal Enstitüleri ve araştırma kaynakları 5P20RR018751 Ulusal Merkezi ve Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler 8 P 20 GM103513 (için G.W.H.) ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Myf5-Cre fareleri | Jax | #007893 | E136 |
| Wnt1-Cre fareleri | Jax | #003829 | kadar erken bir zamanda kas hücresi ekspresyonunu yönlendirir all E13'te Schwann hücreleri var ancak P209 |
| Sox10-Cre fareleri | Jax | #025807 | İleri yaşlarda Schwann hücre ekspresyonunu yönlendirir |
| Koşullu GCaMP3 fareleri | Jax | #029043 | GCaMP3'ü hücreye özgü bir şekilde ifade eder |
| Koşullu GCaMP6f fareleri | Jax | #024105 | GCaMP6f'yi hücreye özgü bir şekilde |
| ifade ederBHC (3- (N-bütilenimidoyl) -4-hidroksi-2H-krom-2-on) | Hit2Lead | # 5102862 | İskelet kası miyozinini bloke eder ancak nörotransmisyonu engellemez6< sup> |
| CF594-&alfa;-BTX | Biotium | #00007 | asetilkolin reseptör kümelerini etiketler |
| Bloklar Nav1.4 voltaja bağlı sodyum kanalı8 | |||
| Silikon Dielektrik Jel; aka Sylgard | Ellswoth Yapıştırıcılar | # Sil Dielec Jel .9KG | Diyaframın minutyen pimler ile hareketsiz hale getirilmesine izin verir |
| Minutien pimleri (0,1 mm çap) | İnce Bilim Araçları | 26002-10 | Diyaframı silikon dielektrik jel üzerine hareketsiz hale getirir |
| Eclipse FN1 dik mikroskop ve nbsp; | Nikon | MBA74100 | Numunenin evrelenmesine ve gözlemlenmesine izin verir |
| Manuel XY Mikroskop Çeviricili Temel Sabit Mikroskop Platformu | Autom8 | MXMScr | Numunenin hareketine izin verir |
| Manuel mikromanipülatör | Narishige | M-152 | Kayıt ve uyarıcı elektrotları tutar |
| Mikroelektrot amplifikatörü | Moleküler Cihazlar | Axoclamp 900A | Keskin elektrot hücre içi elektrofizyolojik kayda izin verir |
| Mikroelektrot düşük gürültülü veri toplama sistemi | Moleküler Cihazlar | Digidata 1550 | Elektrofizyolojik veri toplamaya izin verir |
| Mikroelektrot veri analiz sistemi | Moleküler Cihazlar | PCLAMP 10 Standardı | Elektrofizyolojik veri analizi yapar |
| Kare dalga stimülatörü | Grass | S48 | Kası uyarmak için siniri uyarır |
| Uyaran İzolasyon Ünitesi | Çim | PSIU6 | Stimülasyon artefaktlarını azaltır ve nbsp |
| Borosilikat filamentler, 1.0 mm dış çap, 0.5mm iç çap | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Sinirle uyarılmış kas potansiyellerini kazığa oturtur ve kaydeder |
| Borosilikat filamentleri, 1,5 mm dış çap, 1,17 mm iç çap | Sutter | BF150-117-15 | Uzatılmış ve emme elektrodu için kullanılan |
| Mikropipet Çektirme | Sutter | P-97 | Kayıt elektrotlarını çeker ve hazırlar |
| 1200x1200 piksel, arkadan aydınlatmalı cMOS kamera | Photometrics | Prime 95b | Yüksek çözünürlüklü, yüksek hızlı görüntülemeye izin veren hassas kamera |
| Işık Kaynağı | Lumencor | Spectra X | Floresan obsevasyonu için LED'lerden aydınlatma sağlar |
| Sonsuzluk düzeltmeli floresan suya daldırma objektifleri, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Numunenin görselleştirilmesi için uzun çalışma mesafeleri sağlar |
| Halojen lambalı Fiber Optik Aydınlatıcı | Sumita | LS-DWL-N | Parlak alan gözlemi için aydınlatma sağlar |
| W-View Gemini Görüntü Ayırıcı | Hamamatsu | A12801-01 | Projeler Tek Bantlı |
| Bant Geçiren Filtreler (512/25-25 ve 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Çift bantlı görüntülemeye izin verir |
| 560 nm Tek Kenarlı Dikroik Işın Ayırıcı | Sem Rock | FF560-FDi01-25x36 | Çift dalga boylu görüntülemeye izin vermek için ışık huzmelerini ayıran dikroik ayna |
| Görüntüleme veri toplama sistemi | Nikon | NIS Elements - MQS31000 | Görüntüleme verilerinin toplanmasına izin verir |
| Dalga boyu kontrol modülü | Görüntüleme | MQS41220 | Modülü satın alma |
| Emisyon ayırıcı donanım modülü | Görüntüleme verilerinin toplanması için | Nikon | MQS41410 |
| Görüntüleme veri analiz sistemi | NA | Volumetry 8D5, Fiji | Floresan yoğunluğunun ve diğer görüntüleme verilerinin analizine izin verir |
Kaynaklar
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple func....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
