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Article de méthode

Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique

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DOI :

10.3791/58355

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17 août 2018

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1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, nous présentons un protocole pour effectuer deux photons intravitale d’imagerie et de la cellule analyse des interactions dans la muqueuse trachéale murine après infection par le virus de la grippe. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui étudient la dynamique de cellules immunitaires lors d’infections respiratoires.

Résumé

L’analyse de cellule-cellule ou cellule-pathogen interactions in vivo est un outil important pour comprendre la dynamique de la réponse immunitaire à l’infection. Microscopie intravitale biphotonique (2p-IVM) permet l’observation des interactions entre les cellules dans les tissus profonds dans les animaux vivants, tout en minimisant le photoblanchiment généré lors de l’acquisition de l’image. A ce jour, différents modèles pour 2p-IVM des organes lymphoïdes et non lymphoïdes ont été décrits. Toutefois, l’imagerie des organes respiratoires reste un défi en raison de la circulation liée au cycle de respiration de l’animal.

Nous décrivons ici un protocole afin de visualiser in vivo des cellules immunitaires des interactions dans la trachée chez des souris infectées avec le virus de la grippe à l’aide de 2p-IVM. À cette fin, nous avons développé une plate-forme d’imagerie personnalisée, qui comprenait l’exposition chirurgicale et l’intubation de la trachée, suivie de l’acquisition des images dynamiques des neutrophiles et les cellules dendritiques (DC) dans l’épithélium muqueux. En outre, nous avons détaillé les étapes nécessaires à l’exercice de la grippe par voie nasale infection et flux analyse cytométrique des cellules immunitaires dans la trachée. Enfin, nous avons analysé les neutrophiles et la motilité DC ainsi que leurs interactions au cours d’un film. Ce protocole permet la génération d’images 4D stable et lumineux nécessaire pour l’évaluation des interactions cellule-cellule dans la trachée.

Introduction

La microscopie intravitale biphotonique (2p-IVM) est une technique efficace pour d’imagerie en temps réel des interactions cellule-cellule lorsqu’ils se produisent dans leur environnement naturel1. L’un des principaux avantages de cette méthode est qu’elle permet l’étude des processus cellulaires à une plus grande profondeur de l’échantillon (500 µm à 1 mm) par rapport aux autres de techniques d’imagerie traditionnelle2. Dans le même temps, l’utilisation de deux photons de faible énergie générée par le laser à deux photons minimise la photo-lésions tissulaires généralement associées à l’image acquisition processus2. Au cours de la dernière décennie, 2p-IVM a été appliquée à l’étude des différents types d’interactions cellule-cellule dans plusieurs disciplines3,4,5. Ces études ont été particulièrement pertinents pour étudier les cellules immunitaires, qui sont caractérisent par leur dynamisme élevé et la formation d’importants contacts après les signaux générés par les autres cellules et l’environnement. 2P-IVM a été appliquée également pour étudier les interactions entre les pathogènes et hôte6. En effet, il a été précédemment démontré que certains agents pathogènes peuvent modifier le type et la durée des contacts entre les cellules immunitaires, qui entravent, en conséquence, la réponse immunitaire7.

La muqueuse des voies aériennes est le premier site où la réponse immunitaire contre les pathogènes aéroportés est généré8. En vivo analyse des interactions hôte-pathogène dans ce tissu est donc essentielle de comprendre l’initiation des mécanismes de défense de l’hôte au cours de l’infection. Cependant, 2p-IVM des voies respiratoires est difficile, principalement en raison des artefacts produits par le cycle de respiration de l’animal, ce qui compromet le processus d’acquisition d’images. Récemment, différents modèles chirurgicaux ont été décrites pour imagerie trachée murine9,10,11,12 et poumons13,14,15, 16. Trachéale 2p-IVM modèles représentent un excellent montage pour visualiser la phase initiale de la réaction immunitaire dans les voies aériennes supérieures, tandis que les alvéoles pulmonaires 2p-IVM modèles ne conviennent plus étudier la phase tardive des infections. Les modèles développés pulmonaires présentent une limitation associée à la présence d’alvéoles remplies d’air, qui restreignent la pénétration optique du laser et de rendre la muqueuse des voies respiratoires intrapulmonaires inaccessible pour in vivo de l’imagerie17 . À l’inverse, la structure de la trachée, formée par un épithélium continu, facilite l’acquisition d’images.

Nous présentons ici un protocole qui comprend une description détaillée des étapes requises pour effectuer une infection grippale, préparation chirurgicale des animaux et 2p-IVM de la trachée. En outre, les auteurs décrivent un montage expérimental spécifique pour la visualisation des neutrophiles et les cellules dendritiques (DC), deux types de cellules immunitaires qui jouent un rôle important comme médiateurs du mécanisme de défense contre l’influenza virus18,19 . Enfin, nous décrivons une procédure pour analyser les interactions de neutrophile-DC. Ces contacts auraient dû être divulgués pour moduler l’activation DC et, subséquemment, d’influer sur les réponses immunitaires contre les agents pathogènes20.

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Protocole

Toutes les procédures animales portant sur des souris ont été effectuées conformément aux directives de l’Office vétérinaire fédéral suisse et protocoles animales ont été approuvées par les autorités de vétérinaire local.

1. influenza Infection des souris CD11c-YFP

  1. Prévention des risques biotechnologiques
    Remarque : La souche de souris adaptée de la grippe H1N1 Rico/8/34 A/Puerto (PR8) a été cultivée dans des oeufs fécondés, purifiée et titrée comme décrit précédemment21. Toutes les opérations impliquant des animaux infectés ou des échantillons biologiques ont été effectuées sous une armoire selon niveau biosafety (BSL) de biosécurité 2 conditions.
    1. Nettoyez l’enceinte de sécurité biologique avec une solution d’éthanol 70 % avant et après l’intervention de l’infection.
    2. Jeter tous les déchets produits au cours de cette procédure à la suite appropriée qui biosafety guidelines (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Jeter des déchets solides dans les bacs autoclavable et liquides contaminés dans des sacs en plastique remplis de solution d’éthanol à 70 % ou désinfectant médical.
  2. Infection grippale intranasale
    REMARQUE : B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 sur un fond de C57BL/6J ont été utilisées dans cette étude. Souris ont été maintenus dans l’établissement exempt d’agents pathogènes spécifique à l’Institut de recherche en biomédecine.
    1. Placez un maximum de 5 souris de CD11c-YFP et sexe-appariés selon l’âge (de six à huit semaines) par cage. Attendez au moins deux jours pour l’acclimatation de souris aux conditions de logement avant l’intervention de l’infection.
    2. PR8 stock de dégivrage et de préparer la dilution correspondante à l’aide de froid 1 x saline de tampon phosphate de Dulbecco modifiée sans chlorure de calcium et de chlorure de magnésium (PBS) pour obtenir une concentration finale de 200 unités formant des plaques (PFU) dans 30 µL. Keep dilution virus sur la glace durant toute la procédure.
      Remarque : titrage de chaque lot de virus de la grippe avant son utilisation est recommandée pour assurer une dose précise de l’infection.
    3. Injecter une dose de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par voie intrapéritonéale (i.p.) à l’aide d’une seringue de 1 mL aiguille 26 G.
    4. Attendez que la souris est totalement anesthésiée (perte complète du réflexe de retrait de redressement et de pédale). Une anesthésie profonde est nécessaire pour une infection optimale, puisque les souris non-complètement anesthésiés vont avaler ou expulser l’inoculum de virus, conduisant à des variations de la dose de l’infection.
    5. Placez votre souris anesthésiée en position couchée. Prélever 15 µL d’inoculum de virus. Placer l’embout de la pipette à proximité de la narine gauche de la souris et faites couler l’inoculum viral goutte à goutte. Comme les gouttes doivent être inhalés, ne pas leur Pipeter directement à l’intérieur de la cavité du nez.
    6. Attendez 2 à 5 min et placer l’embout de la pipette contenant le restant 15 µL d’inoculum de virus dans la narine droite.
      Remarque : Pour éviter l’étouffement, distribuer gouttes de petite taille environ 20 incréments de s.
    7. Vérifiez que la souris est respirer correctement et le placer dans une cage en latéral décubitus. Surveiller le souris respiratoire et anesthésie rétablissement (environ 60 min après l’induction).
      Remarque : Il est possible d’infecter plus de 1 souris en même temps. Dans ce cas, administrer un inoculum viral dans la narine gauche de toutes les souris dans une séquence, attendre 2 à 5 min et ensuite administrer le virus dans la narine droite. Pour éviter la variabilité entre les individus, infecter ne dépassant pas 3 souris en même temps.
    8. Contrôler au quotidien santé animale statut et perte de poids.
    9. Euthanasier souris selon le point de terminaison sans cruauté, déterminé par les directives de l’autorité. La méthode d’euthanasie doit être approuvée par les autorités de l’expérimentation animale et doit respecter des normes éthiques locales. Après des expériences de deux photons, euthanasier souris par l’administration d’une surdose de kétamine/xylazine suivie par dislocation cervicale. Dans toutes les autres expériences, utiliser CO2 par inhalation comme une méthode d’euthanasie.
      Remarque : Pour mesurer les titres viraux du trachée infectée, test de dose infectieuse (DICT50) 50 % vitroplants ou PCR temps réel test (RT-PCR) peut être effectuée comme précédemment décrit23.
  3. Évaluation du recrutement de neutrophil dans la trachée par cytométrie en flux
    Remarque : Cette partie du protocole est facultative. Il vise à évaluer le recrutement de neutrophil dans la muqueuse trachéale suite à une infection grippale.
    1. Euthanasier infectés et des souris témoins à post-infection jour 3 (p.i.) par inhalation de CO2 .
      NOTE : Afin d’éviter des dommages à la trachée, évitez d’utiliser la dislocation cervicale pour euthanasier les animaux. En outre, une perfusion de souris euthanasiés est conseillée pour éviter la contamination par les neutrophiles sanguins.
    2. Vaporisez le cou de la souris avec la solution d’éthanol à 70 % et effectuer une incision de la peau à l’aide de ciseaux chirurgicaux de la poitrine au menton.
    3. Séparez les glandes salivaires à l’aide de pinces et exposer la trachée.
    4. Disséquer les muscles autour de la trachée, à l’aide de pinces et ciseaux.
      Remarque : Cette étape doit être exécutée avec soin puisque la trachée peut être facilement endommagée durant la procédure.
    5. Tenez la trachée avec une pince et détachez soigneusement le œsophage par dissection.
    6. Tenant la partie intrathoracique de la trachée avec une pince, faites une incision au début de l’arbre bronchique. Puis détacher la trachée, du larynx et retirez délicatement tout à gauche de la musculature.
    7. Placer l’orgue dans un tube de 1,5 mL contenant RPMI 1640 + milieu HEPES (RPMI) sur la glace.
    8. Préparer le mélange d’enzymes pour la digestion de trachée, contenant 0,26 unités/mL de collagénase (I et II) et de 0,2 mg/mL de DNase I dans RPMI.
    9. Placer la trachée disséquée dans une plaque de 6 puits contenant 1 mL de mélange d’enzymes.
    10. Couper l’orgue en petits morceaux à l’aide de pinces et ciseaux. Maintenir la plaque sur la glace pendant cette étape.
    11. Incuber à 37 ° C pendant 45 min. Pendant ce temps, secouer la plaque toutes les 15 min.
    12. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant 1 mL de tampon de lavage de FACS (2 mM EDTA et 2 % inactivés par la chaleur stérilisée par filtration bovin sérum fœtal (SVF)) dans du PBS.
    13. Remettre en suspension dans la solution avec une pipette de 1 mL pour aider à dissocier les morceaux partiellement digérées du tissu.
    14. Transvaser la solution dans un autre puits en passant le contenu par un filtre à 40 µm. Puis, doucement casser les pièces restantes de l’orgue, pris au piège sur le dessus de la crépine à l’aide d’un piston de seringue de 2 mL.
      NOTE : Smashing morceaux partiellement digérées de trachée sur la crépine est une étape essentielle pour obtenir un nombre optimal de cellules au cours de l’analyse en cytométrie en flux.
    15. Laver le puits et la crépine avec FACS lavage tampon et le transfert, la suspension dans un tube de 5 mL gardée sur glace.
    16. Centrifuger les tubes à 166 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de lavage de FACS.
    17. Procéder à la coloration surface anticorps pour la cytométrie en flux. En bref, bloquer les récepteurs Fc des cellules isolées à l’aide d’un anticorps contre CD16/32, suivie par la coloration de surface. D’identifier correctement les neutrophiles, le panneau de cytométrie de flux doit contenir les anticorps suivants : αLy6G, αCD11b, αCD45, ainsi qu’une viabilité teindre pour exclure les cellules mortes.
    18. Exécuter le contenu entier des échantillons sur un cytomètre en flux et analyser les données.
      1. Pour obtenir un nombre optimal de cellules immunitaires, exécutez la suspension monocellulaire à une vitesse ne dépassant pas 3 000 événements/s. Ceci réduira le nombre d’événements exclus lors de l’acquisition. Utilisant ce protocole, il devrait être possible d’obtenir 1 à 2 millions de cellules par la trachée.

2. isolement et Injection des neutrophiles

Remarque : dans cette procédure, B6.129 (ICR)-souris Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J (CK6-ECFP) ont été utilisés24. Ces animaux exprime des PCP dans tous les types de cellules par un promoteur de la β-actine humaine. Alternativement, il est également possible d’utiliser des souris C57BL/6J pour isoler des cellules et leur tache selon le protocole décrit à l’étape 2.6. La purification et la manipulation des neutrophiles peuvent augmenter leur statut d’activation, susceptibles de modifier leurs propriétés fonctionnelles et migrateurs.

  1. Euthanasier l’animal par l’inhalation de CO2 .
  2. Enlever les deux fémurs et tibias et nettoyez-les délicatement à l’aide de pinces.
  3. Couper les épiphyses des os, puis rincez la moelle osseuse à l’aide d’une seringue de 1 mL remplie de PBS froide stérile, dans un tube de 50 mL gardé sur glace.
  4. Remettre en suspension les cellules avec une aiguille 18 G et filtrage de la suspension cellulaire avec un tamis de 40 μm. Laver une fois avec du PBS à 110 x g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension des cellules dans 2 mL de PBS froid.
  5. Diluer 100 % Percoll 9:1 à 10 x PBS et préparer des solutions gradients de percoll 72 %, 64 % et 52 % à l’aide de la solution 1 PBS x. Soigneusement la couche 2 mL de chacune des trois gradients dans un tube de 15 mL, à partir de la plupart un concentré.
    1. Ajouter avec précaution 2 mL de la suspension de cellules de moelle osseuse sur le dessus les dégradés et centrifuger à 1 100 x g pendant 30 min à température ambiante (RT) sans accélération et freinage.
  6. Soigneusement retirer la bande à l’interface entre 64 % et 72 % et le laver une fois à 200 x g pendant 5 min à 4 ° C avec du PBS froid. Remettre en suspension des cellules dans un volume de 100 μl de PBS et conservez-les sur la glace. La pureté des neutrophiles devrait être supérieur à 90 %.
  7. Éventuellement, les polynucléaires neutrophiles étiquette avec un kit de prolifération cellulaire utilisant le protocole par le fabricant. Ajouter le colorant à la suspension de cellules à une concentration finale de 10 μm dans un volume de 1 mL, incuber à 37 ° C pendant 30 min et laver (166 x g, 5 min).
  8. Estimer la concentration cellulaire utilisant un hémocytomètre et injecter par voie intraveineuse de 5 x 106 cellules dans un volume maximum de 100 μL chez les souris CD11c-YFP+ précédemment infectés à l’aide d’une seringue de 1 mL d’aiguille 26 G, 12 h avant l’imagerie.

3. préparation de la souris pour l’imagerie

  1. Anesthésie
    1. Anesthésier les souris infectées de CD11c-YFP+ à jour 3 p.i. selon l’étape 1.2.3.
    2. Une fois que les souris sont profondément anesthésiés, préparer un cathéter pour le re-dosage de l’anesthésie.
      1. Retirer une aiguille 30 G d’une seringue avec une pincette.
      2. Insérer l’aiguille à un morceau de 20 cm de PE-10 tubes de silicone médical.
      3. Insérer une seringue à aiguille 30 G remplie du mélange de kétamine/xylazine de l’autre côté du tube.
      4. Evacuez l’air à l’intérieur du tube.
    3. Préparer un cathéter de 20 G, relié à un tube d’une machine insufflation d’oxygène pour maintenir une ventilation automatisée (Figure 1 aj’ai). Posez-le sur un ratio de souffle de 130 battements par minute (b.p.m.) avec un volume de marée de 0,2 mL à l’aide d’une alimentation en gaz 100 % d’oxygène.
  2. Préparer la souris pour la chirurgie
    1. Maintenez la souris sur une planche de chirurgicale personnalisée spécifique (Figure 1 aii et iii) sur une plaque chauffante ou un banc chirurgical chauffé fixé à 37 ° C pendant tout le temps de la chirurgie.
    2. Raser les poils du cou de la souris à l’aide d’un rasoir électrique et une crème dépilatoire (Figure 1 bi).
    3. Placez la souris au-dessus de la souris en plastique positionnel (Figure 1 aii-a), gardant la tête d’animal à l’extérieur de la position (Figure 1 bii) pour créer un angle qui facilite l’intubation de la trachée.
    4. Fixer les pattes avant, les pattes et la queue avec ruban chirurgical, humidifier les yeux de la souris avec un gel de la vitamine A enrichi et désinfecter le cou de la souris (Figure 1 bii).
  3. Chirurgie
    1. Préparer les éléments correctement stérilisés à l’autoclave, à savoir, ciseaux, ciseaux microchirurgicale et pinces.
    2. Effectuer une petite incision sur l’axe de temps médian du cou, environ 1 cm de long, dans la zone centrale entre le haut de la poitrine et la ligne passant par le point inférieur de la mandibule (Figure 1 biii).
    3. Se déplacer latéralement les correctifs de la peau et les glandes salivaires et visualiser la trachée, recouverte par les muscles. Puis, disséquer les muscles trachées soigneusement à l’aide de la pince (Figure 1 biii).
    4. Intuber la souris avec un cathéter et commencez la ventilation artificielle (Figure 1 biv).
      Remarque : Le cathéter est composé d’une partie externe en plastique, qui protège la muqueuse trachéale et une aiguille en fer intérieure. La présence de l’aiguille représente la solution idéale pour étendre et stabiliser la trachée et de réguler son exposition. Ventilation artificielle par le cathéter garantira la respiration de la souris.
    5. Commencer immédiatement la ventilation artificielle pour souris moniteur respiratoire.
    6. Fixer le cathéter hauteur et l’orientation à l’aide d’un crochet chirurgical (Figure 1 bv) relié à la tige spécifique sur le plateau chirurgical (Figure 1 aii-b). Exposer la trachée à la même hauteur du menton.
    7. Encercler la trachée de vaseline et couvrez-la avec quelques gouttes de PBS préchauffé pour garantir une bonne hydratation à l’orgue (Figure 1 bvi).
    8. Monter la lamelle sur le dessus de la préparation. Pour cette étape, coller un lamelle couvre-objet sur un support métallique (Figure 1 bvii), qui sera vissé au traducteur de XYZ (Figure 1 aii-c). Ajuster le traducteur XYZ pour placer la lamelle sur le dessus de la préparation chirurgicale.
    9. Placer le cathéter pour l’administration de l’anesthésie par voie intrapéritonéale (Figure 1 bviii).
    10. Injecter de 50 % de la dose initiale de kétamine/xylazine mélange toutes les 30 minutes.
      NOTE : Ré-dosage de 50 % à 25 % du mélange initial kétamine/xylazine est une alternative sûre et valide25. Toutefois, étant donné que ce protocole est en phase terminal et une immobilisation stricte de l’animal est requise pendant toute la procédure, utiliser des doses plus élevées pour maintenir un avion chirurgical profondes de l’anesthésie.

4. l’imagerie in Vivo Time-lapse

NOTE : Acquisition d’images a été réalisée avec un microscope biphotonique vertical, équipé de deux lasers Ti:Sa, chambre d’incubation à température contrôlée et un 25 X / NA 1.1 objectif à immersion d’eau. Le Photomultiplier (PMT) utilisé pour l’acquisition d’images était des détecteurs hybride ou haute sensibilité GaAsP.

  1. Placez la planche chirurgicale avec la souris anesthésiée à l’intérieur de la chambre d’incubation de microscope (préchauffée à 37-38 ° C) et ajouter une goutte d’eau sur la lamelle couvre-objet.
  2. Centre et trouver se concentrent sur le tissu trachéal.
  3. Définissez la fréquence de balayage à 800 Hz, avec 520 x 520 pixels, un champ de vision de 440 x 440 μm2 et ligne 1 moyenne.
    1. Tune Ti:Sa laser à 830 nm pour exciter la génération de seconde harmonique (SHG) de collagène, avec une puissance indicative à la source de 150 mW. Régler le deuxième laser Ti:Sa à 920 nm avec 94 mW à la source, pour exciter les PCP et YFP.
    2. Mise en place la 3D et le mode d’acquisition de timelapse avec excitation simultanée
      NOTE : Gardez les puissances laser aussi bas que possible afin de minimiser le photoblanchiment et phototoxicité.
  4. Record fluorescence en utilisant deux canaux en mode non-descanned, avec un miroir dichroïque maître à 560 nm. Dans la configuration utilisée dans le présent protocole, un second miroir dichroïque diviser le signal à 495 nm pour séparer le canal 1 (filtre d’émission 475/50) du canal 2 (filtre d’émission 525/50) (Figure 2 a). Cette configuration recueille SHG lumière du collagène dans la première manche, tandis que les émissions de PCP sont recueillie dans les chaînes 1 et 2 et YFP est collectée uniquement dans le canal 2.
  5. Définir une gamme de 50 μm selon l’axe Z, avec une taille d’étape de 3 μm (voxel taille 0.86 μm x 3 μm). Enregistrement des images toutes les 30 s pour une durée totale de 30 min.
  6. Si vous le souhaitez, acquérir plusieurs régions. Avant d’exécuter davantage d’acquisitions, vérifier les signes vitaux et réinjecter l’anesthésie par le cathéter si nécessaire (voir étape 3.3.10).
  7. À la fin du processus d’imagerie, euthanasier la souris par le biais de surdosage de kétamine/xylazine suivie par dislocation cervicale.

5. transformation et Quantitative analyse de motilité neutrophile-DC et d’Interaction des images

Remarque : Dans le présent protocole, un logiciel d’imagerie spécialisé a été utilisé pour analyser les données de la microscopie.

  1. Après l’acquisition d’images 4D est terminée, transférer les fichiers (données et métadonnées) sur un poste de travail avec des ressources informatiques suffisantes (suggéré la configuration minimale requise : 32 Go de RAM, un CPU rapide solid-state-disques, récent, dédié GPU basé sur un massivement architecture parallèle).
  2. Ouvrez les fichiers dans les logiciels d’imagerie.
  3. Lire la vidéo et faire en sorte que les cellules d’intérêt sont clairement visibles et que les artefacts d’imagerie sont absentes.
    Remarque : à cette fin, vérifiez que les deux le mouvement de l’échantillon et la variation de luminosité sont suffisamment limités. En effet, ceux-ci représentent des défis pour l' analyse automatique26. Si le mouvement de l’échantillon entre les images adjacentes est excessif, appliquer une méthode de correction de dérive, en utilisant par exemple la chaîne SHG comme référence fixe. Cela permet de mieux mesurer le mouvement des cellules plutôt que le mouvement de l’échantillon. En outre, en présence de fond clair ou débris, taillez les surfaces reconstituées à l’aide de volume comme un paramètre de sélection.
  4. Générer une co-localisation canal spécifique pour les cellules de la CFP+ , afin de séparer le signal entre CFP et le collagène (SHG). À cette fin, désigner un polygone de blocage (Figure 2 bje) qui sélectionne uniquement les voxels ayant une intensité positive dans le canal vert et dans la couche bleue.
    Remarque : Cette procédure peut varier selon le jeu de filtre du microscope et la coloration des cellules. Il est possible en sélectionnant seulement les voxels avec une intensité suffisante en les canaux bleus et le vert. Parmi les outils disponibles, la fonctionnalité « coloc » peut servir à calculer automatiquement le canal de colocalisation basé sur le seuil d’intensité. En outre, méthodes basées sur l’apprentissage automatique peuvent servir pour cette étape avec la supervision d’un expert27.
  5. Détecter et pister les cellules CFP+ , à l’aide de reconstruction de surface automatique et suivi (outil de surface) sur le canal approprié co-localisation.
    Remarque : Curation manuelle de suivi des éventuelles erreurs et l’exclusion des titres d’une durée inférieure à un seuil défini (par exemple, 150 s) peuvent être nécessaires.
  6. Générer une co-localisation canal spécifique pour les cellules CD11c-YFP+ , afin de séparer les signaux CFP et YFP. À cette fin, désigner un mécanisme de sélection polygone (Figure 2 bii) qui sélectionne uniquement les voxels ayant une intensité positive dans le canal vert mais faible intensité dans le canal bleu.
    Remarque : représentant micrographies montrant les signaux du canal 1, canal 2, le canal de co-localisation pour PCP, le canal de co-localisation pour YFP et la combinaison de tous les canaux se trouve dans la Figure 2 biii.
  7. Reconstruire la surface des cellules CD11c-YFP+ et de suivre leur position dans le temps (outil de surface).
    NOTE : Correction manuelle des erreurs de suivi éventuel n’est pas nécessaire pour cette étape. En effet, en raison de la dynamique spatio-temporelle complexe de DC, reconstruire leur surface précise de données 2p-IVM est une tâche difficile qui ne peut être réalisée avec le logiciel de segmentation disponible. Parmi les raisons qui rendent cette tâche difficile, saillies fines variations de luminosité ne permettent pas pour l’utilisation de certaines techniques de traitement d’images, telles que le lissage des filtres ou seuillage statique. Par ailleurs, dans un réseau de DC, il est difficile de séparer les cellules individuelles basés uniquement sur leur apparence en données 2p-IVM. Pour ces raisons, plutôt que de tenter une segmentation précise par le réglage des paramètres du logiciel, nous vous proposons de reconstruire des surfaces non-précises de DC. Gérez ensuite les erreurs possibles au moyen d’indicateurs robustes, comme décrit dans 5,8.
  8. Mesurer la migration cellulaire.
    1. Exporter les mesures classiques de migration pour les PCP+ et cellules CD11c-YFP+ . Parmi celles-ci, la « moyenne de vitesse de voie » indique la vitesse moyenne de migration des cellules, tandis que la « voie de rectitude » indique la directionnalité des cellules. Ces mesures peuvent être exportées vers un fichier de feuille de calcul du logiciel d’imagerie.
    2. Dans les fichiers de feuille de calcul exportée, calculer la « rectitude de piste corrigée » (également dénommée ratio de confinement corrigée) pour les PCP+ et cellules CD11c-YFP+ , qui est défini comme « rectitude de piste » multiplié par la racine carrée de « suivre la durée » divisé par la racine carrée de la durée de la vidéo. Cette mesure est plus robuste que la « piste de rectitude » en présence de courtes pistes28, provenant par exemple des erreurs de suivi.
      Remarque : uniquement les vidéos de la même longueur peuvent être comparés à cette mesure.
  9. Interaction de cellule de mesure.
    1. Définir un contact entre une cellule CFP+ et une cellule CD11c-YFP+ si leur distance (plus proche voxels) est inférieure ou égale à un seuil (c.-à-d., 2 μm).
      Remarque : Ce seuil devrait être suffisamment strict pour détecter un contact uniquement lorsque les cellules sont à proximité. Cependant, nous encourageons à garder ce seuil supérieur à 0, idéalement N fois plus grand que le rayon de voxel (N > 2), parce que la frontière lissage peut rendre la reconstruction des cellules plus petites que la taille de cellule réelle.
    2. Compter le nombre et la durée des contacts entre CFP+ et cellules CD11c-YFP+ . Dans le logiciel d’imagerie c’est possible, par exemple, en exécutant un « baiser et exécuter » plug-in. Ces mesures peuvent être exportées vers un fichier de feuille de calcul de l’onglet statistiques.
  10. Importer les mesures calculées précédemment dans un logiciel de statistique, générer les parcelles et effectuer des tests statistiques.

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Résultats

Dans cet ouvrage, nous décrit un protocole détaillé pour l’étude in vivo la motilité et les interactions entre les neutrophiles et DC au cours de l’infection grippale dans la trachée murine (Figure 3 a). À cette fin, nous avons isolé les neutrophiles CFP+ (92 % de pureté ; Figure 3 b) de CK6-ECFP souris et nous Moutschen transférés dans une souris CD11c-YFP contaminée par un virus. Après cela, nous avons réali...

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Discussion

Cet ouvrage présente un protocole détaillé pour la génération d’images de 4D montrant la migration des neutrophiles Moutschen transférés et de leurs interactions avec les DC lors d’une infection grippale dans la trachée de souris. Le modèle décrit 2p-IVM sera pertinent d’étudier la dynamique de cellules immunitaires lors d’une infection des voies respiratoires.

Récemment, plusieurs modèles basés sur la visualisation dynamique de cellules dans les voies aériennes ont été développés

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation National Suisse (FNS) (176124, 145038 et 148183), la Commission européenne Marie Curie réinsertion Grant (612742) et le SystemsX.ch une subvention pour la D.U.P. (2013/124).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Gigasept instru AFSchü ; lke & Mayr GmbHSolution à 4 %
Souris CD11c-YFPLaboratories008829souris ont été élevées en interne
Souris CK6-ECFPLaboratories004218souris ont été élevées en interne
1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline modifié sans chlorure de calcium et chlorure de magnésiumSigmaD8537-500ML
10x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline modifié sans chlorure de calcium et chlorurede magnésium SigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigmaE0414-1LStocker à 4° ; C
Ketamin Labatec LabatecPharma7680632310024Magasin à RT, magasin à 4 ° ; C en solution d’un mélange ket/xyl
Rompun 2 % (xylazine)Bayer6293841.00.00Conserver à RT, conserver à 4 ° ; C en solution de mélange ket/xyl
26 G 1 mL Sub-Q BD PlastipakBD Plastipak 305501
30 g, 0,3 mL BD Seringues à insuline microfinesBD324826
Falcon 40 & micro ; m Cell StrainerCorning352340
Seringues 2 mLBD Plastipak300185
Microlance 3x 18 G aiguillesBD304622
Introcan Safety 20 G (cathéter)Braun4251652.01
6 Well Cell Culture ClusterCostar3516
RPMI medium 1640 + HEPES (1x)ThermoFisher Scientific42401-018Magasin à 4° ; C
liberase TL Research GradeRoche5401020001Se stocker à -20 ° ; Mélange C/collagénase (I et II)
DNAse IAmresco (VWR)0649-50KUStocker à -20 ° ; C
CellTrace Coloration violetteThermoFisher ScientificC34557Conserver à -20 ° ; C
EDTASigmaEDS-500G
Sérum de Bovin FœtalGibco10270-106Conserver à -20 ° ; C
PE-10 Micro Tube Médical2Biological Instruments SNC#BB31695-PE/1
Ruban Plastique ChirurgicalM Plast
ViscotearsBausch & LombStore at RT
PlasticineOhropax
High Tolerance Glass Coverslip 15 mm RoundWarner Instruments64-0733
SomnoSuite Portable Animal Anesthesia SystemKent ScientificSS-01
Nuvo Lite mark 5GCE medline14111211
MiniTag (anesthésie gazeuse et banc chauffant)Tem Sega
SURGICAL BOARDUniversité de Berne
TrimScope II Microscope à deux photonsLaVision Biotec
Chameleon Vision Ti :Sa lasersCoherent Inc.
Objectif d’immersion dans l’eau 25X NA 1.05OlympusXLPLN25XWMP2
The Cube& La boîte Chambre d’incubation et régulateur de températureLife imaging Services
Imaris 9.1.0BitplaneLogiciel d’imagerie
GraphPad Prism 7GraphPadLogiciel statistique
Jackson Jackson

Références

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