В этом исследовании мы представляем протокол для анализа двух Фотон прижизненной изображений и ячеек взаимодействия в мышиных слизистой оболочки трахеи после заражения вирусом гриппа. Этот протокол будет актуален для исследователей, изучения динамики иммунных клеток во время инфекции дыхательных путей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Изображений взаимодействия клеток в слизистой оболочки трахеи во время инфекции вируса гриппа с помощью двух Фотон прижизненной микроскопии
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Анализ ячеек или ячеек возбудитель взаимодействия в естественных условиях является важным инструментом для понимания динамики иммунной реакции на инфекции. Двух Фотон прижизненной микроскопии (2P-IVM) позволяет наблюдения взаимодействий клеток в глубоких тканях живых животных, при сведении к минимуму Фотообесцвечивание, созданные во время захвата изображений. На сегодняшний день, были описаны различные модели для 2P-IVM лимфоидных и не лимфоидных органов. Однако томография органов дыхания остается проблемой из-за движения, связанных с циклом дыхания животных.
Здесь мы описываем протокол для визуализации в vivo иммунных клеток взаимодействий в трахею мышей, инфицированных вирусом гриппа, используя 2 P-КБПБ. С этой целью мы разработали пользовательские изображений платформы, которая включала хирургического воздействия и интубация трахеи, после приобретения динамических изображений нейтрофилов и дендритных клеток (DC) в эпителии слизистой оболочки. Кроме того мы подробно шаги, необходимые для выполнения гриппа интраназального инфекции и потока гранулярных анализ иммунокомпетентных клеток в трахею. Наконец мы проанализировали нейтрофилов и DC моторики, а также их взаимодействия в ходе фильма. Этот протокол позволяет для создания стабильных и яркие изображения 4D необходимое для оценки взаимодействия ячеек в трахею.
Введение
Двух Фотон прижизненной микроскопии (2P-IVM) является эффективным методом для реального времени изображений к ячейке взаимодействий, как они происходят в их природной среды1. Одним из главных преимуществ этого метода является, что она позволяет изучение клеточных процессов на большей глубине образца (500 мкм до 1 мм) по сравнению с другими традиционными изображений методы2. В то же время использование двух низкой энергии фотонов, порожденных два фотона лазерного минимизирует фото повреждение тканей, обычно связанных с процессом приобретения изображения2. В течение последнего десятилетия 2P-IVM был....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Всех животных процедуры с участием мышей были исполнены в соответствии с швейцарским Федеральным управлением ветеринарии руководства и животных протоколы были одобрены властями местным ветеринаром.
1. гриппа инфекция CD11c-рекламы ЯФП мышей
- Биобезопасности
Примечание: Мыши адаптированы штамм гриппа H1N1 Рико/8/34 A/Puerto (PR8) вырос в оплодотворенных яиц, очищенная и титруют как описано21. Все действия, связанные с зараженных животных или биологических образцов были проведены под биобезопасности кабинета по биобезопасности уровня (BSL) 2 условий.- Очистите биобезопасности кабинет....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этой работе мы описали подробный протокол учиться в vivo моторику и взаимодействия между нейтрофилов и DC во время инфекции гриппа в мышиных трахеи (рис. 3A). С этой целью мы изолированы CFP+ нейтрофилов (92% чистоты; Рисунок 3B) CK6-ECFP мышей и мы восприимчивую передало их в CD11c-рекламы ЯФП мышь инфицированных гриппом. После этого мы провели 2P-IVM трахеи на 3 день п.и. В этот момент времени мы наблюдали.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта работа представляет подробный протокол для поколения 4D изображения показаны миграции восприимчивую передаваемых нейтрофилов и их взаимодействия с DC во время инфекции гриппа в мыши трахеи. Описанные 2P-IVM модель будет отношение к изучению динамики иммунных клеток во время инфекции в дыхательных путях.
Недавно несколько моделей, основанных на визуализации динамики клетки в дыхательных путях были развитые9,10,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана швейцарского национального фонда (СНФ) гранты (176124, 145038 и 148183), Грант реинтеграции Мари Кюри Европейской Комиссии (612742) и SystemsX.ch на грант для D.U.P. (2013/124).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Gigasept instru AF | Schü lke & Mayr GmbH | 4% раствор | |
| CD11c-YFP мыши | Jackson Laboratories | 008829 | мыши были выведены собственными |
| мышами CK6-ECFP | Laboratories | 004218 | мыши были выведены собственными |
| 1x фосфатный буферный физиологический раствор Dulbecco's модифицированный без хорида кальция и хлорида магния | Sigma | D8537-500ML | |
| 10x Фосфатный буферный физиологический раствор Дульбекко, модифицированный без хорида кальция и хлорида магния | Sigma | D1408-500ML | |
| Percoll PLUS | Sigma | E0414-1L | Хранить при 4° C |
| Ketamin Labatec | Labatec Pharma | 7680632310024 | магазин в RT, магазин в 4 ° C при нахождении в растворе кет/ксиловой смеси |
| Ромпун 2% (Ксилазин) | Байер | 6293841.00.00 | Хранить при РТ, хранить при 4°С; C при нахождении в растворе смеси кет/ксил |
| 26 г 1 мл Sub-Q BD Plastipak | BD Plastipak | 305501 | |
| 30 г, 0,3 мл BD Micro-Fine Insulin Шприцы | BD | 324826 | |
| Falcon 40 µ m Клеточный фильтр | Corning | 352340 | |
| мл Шприцы | BD Plastipak | 300185 | |
| Microlance 3x 18 G иглы | BD | 304622 | |
| Introcan Safety 20 G (катетер) | Braun | 4251652.01 | |
| 6 Well Cell Culture Cluster | Costar | 3516 | |
| RPMI medium 1640 + HEPES (1x) | ThermoFisher Scientific | 42401-018 | Магазин по адресу 4° C |
| Liberase TL Research Grade | Roche | 5401020001 | хранить при температуре -20 °de; С/коллагеназа (I и II) смесь |
| DNAse I | Amresco (VWR) | 0649-50KU | Хранить при -20° C |
| CellTrace Фиолетовый морилка | ThermoFisher Scientific | C34557 | хранить при -20 °°; C |
| EDTA | Sigma | EDS-500G | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 10270-106 | хранить при -20 °deg; C |
| PE-10 Микро медицинская трубка | 2Biological Instruments SNC | #BB31695-PE/1 | |
| Хирургическая пластиковая лента | M Plast | ||
| Viscotears | Bausch & Lomb | Store at RT | |
| Plasticine | Ohropax | ||
| High Tolerance Glass Coverslip 15 мм круглый | Warner Instruments | 64-0733 | |
| SomnoSuite Портативная система для анестезии животных | Kent Scientific | SS-01 | |
| Nuvo Lite mark 5 | GCE medline | 14111211 | |
| MiniTag (газовая анестезия и нагревательная столовая) | Tem Sega | ||
| SURGICAL BOARD | Бернский университет TrimScope | ||
| II Двухфотонный микроскоп | LaVision Biotec | ||
| Chameleon Vision Ti:Sa лазеры | Coherent Inc. | ||
| 25X NA 1.05 объект для погружения в воду | Olympus | XLPLN25XWMP2 | |
| The Cube& Коробка инкубационной камеры и регулятора температуры | визуализации жизни | ||
| Imaris 9.1.0 | Программное обеспечение для визуализации | битовой плоскости | |
| GraphPad Prism 7 | Статистическое программное обеспечение | GraphPad |
Ссылки
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Fein, M. R., Egeblad, M.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
