Vi presenterar ett protokoll för den klassiskt villkora av utnyttjas myror som tillåter forskare att studera visuell inlärning och minne formation på en nivå av analysen inte möjligt med fritt rörliga individer.
Flera arter av insekter har blivit modellsystem för att studera lärande och minne formation. Även om många studier fokuserar på fritt rörliga djur, studier genomför klassisk betingning paradigm med utnyttjas insekter har varit viktiga för att undersöka exakt ledtrådar som individer lär sig och de neurala mekanismerna bakom lärande och minnesbildning. Här presenterar vi ett protokoll för frammana visuella associativ inlärning i trä myror genom klassisk betingning. I detta paradigm, är myror utnyttjas och presenteras med en visuell stickrepliken (en blå kartong), villkorlig stimulus (CS), parat med en apéritivo socker belöning, den ovillkorliga stimulansen (US). Myror utföra en överkäke-Labium förlängning Reflex (MaLER), ovillkorlig svaret (UR), som kan användas som en avläsning för lärande. Utbildningen består av 10 försök, en 5 minuters intertrial mellanrum (ITI). Myrorna är också testade för minne lagring 10 minuter eller 1 timme efter träning. Detta protokoll har potential att låta forskare att analysera, i en exakt och kontrollerad sätt, information om visuella minnesbildning och neurala grunden för inlärning och minne formation i trä myror.
Insekter har använts flitigt som modeller för att studera lärande och minne formation1. En särskilt framgångsrik ven forskning involverar användande klassisk betingning av återhållen djur, som ger exakt kontroll över ledtrådar att vara lärd och tillåter forskare att undersöka de neurala mekanismerna bakom inlärning och minne. Majoriteten av studierna har fokuserat på de apéritivo klassisk betingning av honungsbinas arbetstagare, Apis mellifera mellifera. Honungsbinas arbetstagarna utbildas för att associera en CS med en USA som väcker UR. I detta paradigm, ursprungligen utvecklat av Takeda2 och Bitterman o.a. 3, UR är snabel förlängning Reflex (PER), USA är socker och CS är en lukt. Bina lära sig sambandet mellan CS och USA och kan bilda ett långsiktigt minne av denna förening.
Den ursprungliga paradigm med PER som UR har använts att riva upp de nervbanor som underbygger olfactory lärande i bin4. Det har ändrats på flera olika sätt att testa inlärning av olika sensoriska stimuli, inklusive visuella stimuli5,6,7, att införliva aversiva inlärning med undertryckandet av den PER8 eller tillägget Sting Reflex (SER)9 UR samt att testa lärande i andra arter, såsom humlor10 och bananflugor11. Även om minnesbildning med flera modaliteter har studerats genom klassisk betingning, visuell inlärning är fortfarande svåra att observera använder denna metod, även i arter som visar en hög grad av visuellt lärande förmåga under födosök, såsom honungsbin.
Nyligen genomförda studier har tillämpat ett liknande förhållningssätt till insekter som inte har en snabel, till exempel gräshoppor, som utför de Palp öppnande svar (POR)12, och myror, som utför den Maxilla-Labium förlängning Reflex (MaLER)13. Detta har redan avslöjat fas-specifik inlärningsförmåga som matchar fas-specifik utfodring i två olika öken locust fenotyper, den sällskaplig och strategier de solitarious former, åter genomdriva tanken att minnesbildning måste matcha ekologiska behov14. Studier på olfactory lärande i myror har dessutom visat likheter mellan myror och honungsbin i minnesbildning och lagring, med långsiktigt minne lagring, 72 timmar efter träning, att vara beroende av proteinsyntes15.
Dessa anpassningar av det ursprungliga paradigmet har låtit inlärning och minne formation studeras med många modaliteter och i flera modell arter. Detta är nödvändigt för att identifiera mekanismer av minnet bildning gemensamt för insekter utan även för att identifiera skillnader som återspeglar särskilt ekologi för inlärning och minne hos olika arter. Det huvudsakliga målet med det protokoll som vi beskriver här är att tillhandahålla ett sätt att utföra klassisk betingning experiment med en visuell villkorlig stimulans med en allmänt studerade ant art, Formica rufa. Det utfärdas från vår studie av visuellt lärande i Skogsmyror16, vilket är också en anpassning av visuella klassisk betingning paradigm.
Klassisk betingning är en av de mest väletablerade paradigmerna att studera inlärning och minne. Det protokoll som vi presenterade här är en anpassning av paradigm utformat för honey bee arbetstagare2,3 och därefter används med flera andra arter, såsom humlor, bananflugor, som också använder PER som en avläsning för att lära sig10 ,11, och gräshoppor och myror, som använder POR och MaLER, respektive12,13. Med detta protokoll är det möjligt att träna utnyttjas Skogsmyror att lära sig sambandet mellan en visuell stickrepliken och socker belöning och analysera retention av detta kort (10 min) och mitt-sikt (1 timme) minne16.
I någon beteende experiment är det nödvändigt att ta hänsyn till kritiska steg som kan minimera variabiliteten i djurens svaren. I protokollet presenteras här, åtgärder flera för att minimera variabiliteten innan och under träning. Före starten av experiment, kolonin behöver vara svalt i minst två dagar och myror bör väljas baserat på deras villighet att äta från en socker droppe i rutan innehav. Att välja myror på detta sätt är avsedd att maximera chansen till utbildning myror som är motiverade att mata. Försiktig hantering är också viktigt eftersom det kan bidra till att minska stressnivån, som stör lärande om det är alltför intensiv21. I detta syfte bör myror vara sövda med kalla bo orörlig medan som utnyttjas, eftersom någon rörelse (för att fly) under detta förfarande kan vara en källa till stress. Vidare bör kontakten mellan myran och vax vara minimal, undvika kontakt mellan antennerna och heta vax eller tråd, som kan orsaka skada. Även om dessa observationer formellt inte har analyserats, tycktes antenner röra sig med ett visst mönster under lärande.
Under experiment är försiktig leverans av socker också viktigt att hålla myror motiverad. Igen, medan detta inte analyserats formellt, abrupt mat leverans tycktes orsaka ytterligare stress på myran, som i sin tur ledde till brist på motivation och lärande. Dessutom skall sackaroshalten levereras under utbildningen bör en minskad koncentration (200 g/L) att undvika mättnadskänsla innan slutet av utbildningen och testning. Detta tillåter MaLER vara en bra kandidat ovillkorligt svar eftersom, tillsammans med en låg spontana prestanda av detta svar till visuell stickrepliken, det också inte mätta över prövningar. Slutligen, i motsats till de flesta klassisk betingning studier2,3,5,6,7,8,9,10, 11 , 12 , 13, vi tränade en ant på tiden fram till slutet av experimentet, lämnar den på plats mellan prövningar i stället för att ta bort det för att testa en annan ant. Utbildning flera myror tillsammans tycktes ge mer varierande resultat, vilket kan bero på en ökad stress och/eller konflikt mellan visuell information orsakas av en fullständig förändring av landskapet. För att minska varaktigheten av varje experiment, använde vi en 5-minuters ITI istället för de 10 minuters ITI används i de flesta klassisk betingning studier16. Även om alla dessa överväganden bör hjälpa säkerställa att myrorna är motiverade att mata och lära sig under träning, kan inte vissa variabilitet undvikas. Vi rekommenderar att använda myror som verkar ha normal social, apéritivo och locomotion beteende och exklusive myror från analysen nu de misslyckas med att mata på en utbildning rättegång eller ett test.
Arten av CS testades inte i denna studie. Även om vi har använt en blå visuell stimulans eftersom myror av samma släkte är känsliga för dessa våglängder18, kan andra färger också läras i samband med en belöning. Ytterligare experiment skulle krävas att fullständigt karakterisera färgerna som sett och lärt i denna uppsättning. Detta gäller även för olika former och storlekar av visuell stickrepliken. Vi har inte testat om myror rumslig upplösning skulle räcka för att skilja den visuell stimulans som presenteras här på avstånd från myrorna ögon det presenterades på. Även om Skogsmyror fasettögon har beskrivits vad gäller storlek och antal fasetter22, att vår kunskap, har deras rumsliga upplösningen inte fullt beskrivits ännu. Detta har dock beräknats för Melophorus magoti23. En liknande karakterisering av trä myrorna, eller andra testade insekter ögon skulle bidra till en tydlig utredning av funktioner i den visuella cue som observerats och lärt av djuren. Dessutom ingår vi motion när du presenterar den visuella stimulansen till myran eftersom det har visat sig spela en roll i honungsbinas associativ inlärning under klassisk betingning6. Dock kunde detta inte testades också i denna studie och, på grund av hur olika rörelse flygande insekter jämfört med promenader insekter, skillnader mellan honungsbinas och ant visuella klassisk betingning observeras.
På en sista anmärkning har vi kunnat undersöka långsiktiga minne lagring eftersom myror inte överlevde att utnyttjas för sådana långa perioder efter träning. Men i efterföljande satser av experiment, vi har hållit myror lever och motiverade att äta och lära sig när utnyttjas och lämnade dem över natten i en mörk och fuktig miljö (att placera en låda över dem). Detta paradigm kunde därför användas för att nysta upp långsiktigt minne lagring av trä myror, förutom kort och mitten sikt minne.
Med denna enkla procedur anpassad från allmänna klassisk betingning paradigm, är det möjligt att studera förvärv och bibehållande av visuella minnen i utnyttjas trä myror, som har studerats allmänt i paradigm använder gratis-rörliga djur. Detta paradigm har potential att användas för att analysera personlighetens grund i visuellt lärande i en mycket väletablerad modell för insekt navigering.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Tom Collett och Cornelia Buehlmann för att dela värdefull information om insamling och underhåll av trä Myra kolonier. Författarna också tacka Justine Crevel för att kommentera tidigare versioner av denna artikel.
Fluon | Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK | ACS 109; ACS 112; ACS 114 | For preventing insects from scaping |
Crickets | Blades Biological Ltd, Edenbridge, UK | LZJ 217 | Given to the ant colonies as protein source |
Natural Pine Rosin/Resin | Minerals-water Ltd, Rainham, UK | 500g | Given to the ant colonies for sanitation |
Austerlitz Insect Pin | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 26000-40 | For harnessing ants |
High speed camera | Edmund Optics Inc., Barrington, USA | eo-13122M | MaLER recordings during training and testing |
Macrolens | Cannon, Surrey, UK | EF 100 mm f/2.8 L Macro IS USM | MaLER recordings during training and testing |
Software | IDS Imaging Development Systems GmbH | uEye64 | MaLER recordings during training and testing |
Blue Cardboard | john smith's at Union Store, University of Sussex | JACK-PJM41358 | Constitutes de conditional stimulus |
Syringe | Fisher Scientific LTD, Loughborough, UK | BD Plastipak 300185case; Product Code.12369289 | US and CS (attached) presentation |
Needle (0.5 x 16 mm) | Fisher Scientific LTD, Loughborough, UK | BD Microlance 300600; Product Code:10442204 | US and CS (attached) presentation |