大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。
Summary
ここで固定、取付け、イメージング、およびイメージ作成後の手順でショウジョウバエの大人の足に蛍光タンパク質を持つ軸索ターゲットを視覚化するプロトコルについて述べる。
Abstract
神経の仕様の仕事の大半は、 Cなどの遺伝学的および生理学的にも扱いやすいモデルで行われています。線虫、ショウジョウバエの幼虫、魚、すべての歩行の彼らの主なモードとして (のようなクロールまたは水泳) 波動運動に従事します。しかしより個々 の運動ニューロン (MN) の仕様の理解を洗練された-少なくとも疾患の治療に知らせるという点で-より良いモデルの複雑な付加物に基づいた歩行スキームを均等に扱いやすいシステムを要求脊椎動物。アダルトショウジョウバエ運動システム歩いて担当を満たしているこれらすべての条件は、簡単にこのモデルでは、少数の容易に識別脚 MNs (足あたり約 50 MNs) の仕様を検討することが可能だから両方を使って広大です強力な遺伝学的ツールと付属物に基づいた歩行スキームの生理のコンテキストでは配列です。ここで大人のフライで脚筋の神経支配を視覚化するプロトコルについて述べる。
Introduction
脊椎動物の四肢のようなショウジョウバエの大人の脚は、セグメントに編成されます。各フライの脚には、複数の筋線維1,2を含む 14 の筋肉が含まれています。大人の脚 MNs の細胞体は、T1 (老熟)、(キリギリス)、T2 と T3 (誘発) 大脳腹側神経索 (VNC) 脊椎脊髄 (図 1) に類似した構造の両側にあります。対象筋 (coxa、転子、大腿骨、脛骨) の同側の脚の 4 つのセグメント (図 1)3、各神経節約 50 MNs があります。重要なは、それぞれ個々 の大人の脚 MN は、動物3,4間のステレオタイプが強くユニークな形態の id です。これらのすべてのユニークな MNs は神経芽細胞 (NBs) 幼生3,4脚 MNs の生産と呼ばれる 11 の幹細胞から派生しました。すべて幼虫の段階の終わりに彼らの特定樹状アーバーと、ユニークな形態の3、4を定義する軸索ターミナルのターゲットを取得する変態未熟な後 MNs を区別します。以前転写因子 (TFs) の組合せのコードが各ショウジョウバエ大人の脚は MN5のユニークな形態を指定する仮説をテストしました。モデルとして系統 B、MNs のうち 7 つを生成し、TFs 後大人の脚 MNs で表現の組合せコードが彼らの個々 の形態を指定することを示した 11 NB 系統の 1 つを使用しました。MNs の TF のコードを reprograming に予測可能な方法で MN の形態を切り替えることがきました。我々 はこれらの TFs を呼び出す: Mtf (形態 TFs)5。
大人の MNs の形態学的分析の最も困難な部分の 1 つは高解像度の厚さと自動蛍光キューティクルを介して軸索を視覚化します。我々 は通常DVglut Gal4などのバイナリ表現システムと MNs で表される膜タグ GFP と軸索をラベル/UA mCD8::GFPまたはDVglut QF/擬 mCD8::GFP, DVglutが強いドライバーで表されます運動ニューロン6。抑制型マーカー (MARCM)7、cis MARCM8、または MARCMbow5とモザイク解析など他のクローン技術と、これらのツールを組み合わせて、我々 は表現型の分析を行う MNs のサブポピュレーションを GFP 発現を制限できます。簡単に軸索。大人の脚の内部構造の (1) の固定など大人のショウジョウバエ脚に固有の特定の問題に取り組むことによって脚 MN 軸索形態のイメージングおよび後続の三次元再構成のためそのままを維持するためにプロトコルを生成します。軸索形態、内因性の蛍光式、脚の筋肉に影響を与えずに観察の下でそしてイメージング、および (3) 画像のキューティクルを取得する処理のための適切な方向の全体的な構造を維持するために脚の (2) の取付背景として軸索の蛍光信号。このプロトコルは、MN 軸索における蛍光発現の検出のために詳述されている、間は、節足動物の脚 neuromusculature の他のコンポーネントの可視化に適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
多くの暗い顔料を含んだ大人のショウジョウバエと他の節足動物のキューティクルは、自分の体の内部構造を表示するための主要な障害です。さらに、それは強く固定によって悪化している自動蛍光です。これらの 2 つの機能は、蛍光染料または外骨格を持つ動物の体内分子の観測は非常に問題になります。
手順については、ラボで日常的に使用する軸索軌道と大人の<e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ロバート ・ ルナールにありがとうはえの食糧媒体の準備します。この作品は R.S.M. に NIH グラント NS070644 によってサポートされていると J.E. に ALS 協会 (#256)、FRM (#AJE20170537445)、ATIP アベニール プログラムから資金調達
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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