Visualisera Drosophila ben motorneuronen axoner genom vuxen nagelbanden
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera axonal inriktning med ett fluorescerande protein i vuxen ben av Drosophila av fixering, montering, imaging och efter imaging steg.
Abstract
Merparten av arbetet på specifikationen neuronala har utförts i genetiskt och fysiologiskt eftertraktansvärda modeller såsom C. elegans, Drosophila larver och fisk, som alla bedriver undulatory rörelser (som kryper eller simning) som sin primära läge för förflyttning. Dock en mer sofistikerad förståelse av enskilda motorneuron (MN) specifikationen — åtminstone när det gäller att informera sjukdom terapier – kräver ett lika lätthanterlig system som bättre modeller komplexa bihang-baserade locomotion systemen i ryggradsdjur. Adult Drosophila rörelseapparaten som ansvarar för promenader uppfyller alla dessa kriterier med lätthet, eftersom i denna modell är det möjligt att studera specifikationen av ett litet antal lätt urskiljas ben MNs (cirka 50 MNs per ben) båda med en stor utbud av kraftfulla genetiska verktyg, och i fysiologiska samband med ett bihang-baserade locomotion system. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera den ben muskler innervationen i en vuxen fluga.
Introduction
Som ryggradsdjur extremiteten, är Drosophila vuxen benet indelad i segment. Varje flyga ben innehåller 14 muskler, som består av flera muskelfibrer1,2. För de vuxna ben MNs cell organ ligger i T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) och T3 (metathoracic) ganglierna på varje sida av den ventrala nerv sladden (VNC), en strukturell analog med ryggradsdjur ryggmärgen (figur 1). Det finns cirka 50 MNs i varje ganglier, som riktar muskler i fyra segment av ipsilaterala benet (coxa, trochanter, lårbenet och skenbenet) (figur 1)3. Viktigt, har varje enskild vuxen ben MN en unik morfologisk identitet som är mycket stereotypa mellan djur3,4. Alla dessa unika MNs härleds från 11 stamceller, kallas neuroblasts (NBs) producerar ben MNs under det larval arrangerar3,4. I slutet av larval arrangerar alla skilja de omogna postmitotic MNs under metamorfos att förvärva sina specifika dendritiska arbors och axonal terminal mål som definierar deras unika morfologi3,4. Tidigare testat vi hypotesen att en kombinatorisk kod av transkriptionsfaktorer (TFs) specificerar av varje Drosophila vuxen ben MN5unika morfologi. Som modell använde vi härstamning B, en av de 11 NB härstamningar som producerar sju av MNs och visat att en kombinatorisk kod av TFs uttryckt i postmitotic vuxen ben MNs dikterar deras individuella morfologier. Av reprograming TF koden för MNs har vi kunna växla MN morfologier på ett förutsägbart sätt. Vi kallar dessa TFs: MTF-plattformar (morfologiska TFs)5.
En av de mest utmanande delarna av de morfologiska analyserna av vuxen MNs är att visualisera axoner genom en tjock och auto-fluorescerande nagelband med hög upplösning. Vi brukar märka axoner med en membran-taggade GFP som uttrycks i MNs med ett binärt uttryck system, såsom DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP eller DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, där DVglut är en stark drivkraft som uttrycks i motoneurons6. Vi kan begränsa GFP uttrycket till subpopulations av MNs att göra fenotypiska analysen genom att kombinera dessa verktyg med andra klonal tekniker såsom mosaic analys med en repressible markör (MARCM)7, cis-MARCM8eller MARCMbow5, av axoner lättare. Vi har genererat ett protokoll för att hålla benet MN axonal morfologi intakt för bildhantering och efterföljande 3D rekonstruktion av specifika frågor inneboende till vuxen Drosophila ben såsom (1) fixering av det inre strukturerar av vuxen ben utan att det påverkar axon morfologi, endogena fluorescerande uttryck och lägga benen på ryggenmuskulaturn, (2) montering av benet att bevara den övergripande strukturen under ett täckglas och i lämplig riktning för bildhantering, och (3) bildbehandling för att erhålla nagelbanden bakgrund samt axonal fluorescerande signal. Medan detta protokoll har varit detaljerade för detektion av fluorescerande uttryck i MN axoner, kan det användas för att visualisera andra komponenter i ben neuromusculature i leddjur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nagelbanden vuxen Drosophila och andra leddjur, som innehåller många mörka pigment, är ett stort hinder för visning av strukturer inuti kroppen. Det är dessutom starkt auto lysrör som förvärras av fixering. Dessa två funktioner är mycket problematisk för observationer av fluorescerande färgämnen eller molekyler inuti kroppen av djur med ett exoskelett.
Förfarandet som vi har beskrivit och som vi använder rutinmässigt i labbet ger ren och detaljerade bilder av axon banor och de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Robert Renard för förbereda flyga mat Media. Detta arbete var stöds av en NIH grant NS070644 till R.S.M. och finansiering från ALS Association (nr 256), FRM (#AJE20170537445) och ATIP-Avenir Program till J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
