Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Resumo

Um protocolo para a elucidação da planta tilacoides proteína complexa organização e composição com poliacrilamida nativa azul gel eletroforese (BN-página) e 2D-SDS-PAGE é descrito. O protocolo é otimizado para a Arabidopsis thaliana, , mas pode ser usado para outras espécies de plantas com pequenas modificações.

Resumo

Cadeia de transferência de elétrons fotossintética (ETC) converte energia solar em energia química na forma de NADPH e ATP. Quatro grandes complexos de proteínas incorporado em tilacoides membrana colheita solar energia para conduzir os elétrons da água para NADP⁺ através de dois fotossistemas e usar o gradiente de prótons criado para a produção de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b₆f (Cyt b₆f) e ATPase são todos os complexos Multiproteicos com orientação distinta e dinâmica na membrana tilacoides. Informações valiosas sobre a composição e as interações dos complexos proteína na membrana tilacoides podem ser obtidas pelo solubilizing os complexos da integridade da membrana por detergentes suaves, seguidos pelo nativo gel de separação eletroforética do complexos. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método analítico usado para a separação de complexos de proteínas em sua forma nativa e funcional. O método pode ser usado para purificação de complexo de proteínas para análise estrutural mais detalhada, mas ele também fornece uma ferramenta para dissecar as interações dinâmicas entre os complexos de proteína. O método foi desenvolvido para a análise de complexos de proteína respiratória mitocondrial, mas desde então foi otimizado e melhorado para a dissecação dos complexos proteína tilacoides. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado atualizado para análise de complexos de proteínas fotossintéticas lábeis e suas interações em Arabidopsis thaliana.

Introdução

Proteína multisubunit grandes complexos fotossistema PSI e PSII, Cyt b₆f e ATPase coordenam a produção de NADPH e ATP em reações de luz fotossintéticas. Nos cloroplastos de plantas superiores, os complexos estão localizados na membrana tilacoides, que é uma estrutura de membrana estruturalmente heterogêneo, composto por grana apresso e não-apresso estroma contém. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método amplamente utilizado na análise de grandes multisubunit complexos de proteínas em sua forma nativa e biologicamente ativo. O método foi criado para a dissecção da proteína de membrana mitocondrial complexos^1....

Protocolo

1. preparar BN^1,2,3 do Gel

1. Configure o rodízio de gel com placas de 8 x 10 cm (vidro retangular e placa entalhada da alumina) de acordo com as instruções do fabricante usando espaçadores de 0,75 mm.
2. Coloque num prato de agitar um mixer gradiente e conectá-lo com a bomba peristáltica por uma tubulação. Anexar uma agulha da seringa para a outra extremidade do tubo e colocar a agulha entre a placa de vidro e alumínio. Agitador magnético do lugar para o "pesados" (H)-câmara.
3. Preparar a 3,5% (v/v) e 12,5% (v/v), soluç....

Resultados

Um sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE na Figura 1 demonstra a separação de digitonin e complexos de proteína β-DM-solubilizado tilacoides e sua composição de subunidade de proteína detalhadas. O padrão complexo de proteínas de digitonin solubilizado contém (gel de horizontal na parte superior no topo da figura 1A) contém a megacomplex do FSII LHCII-PSI, duas grandes razões do FSII-LHCII (sc), supercomplex PSI-LHCII, monômer.......

Discussão

As máquinas de conversão de energia fotossintética é composta por grandes multisubunit complexos de proteínas, que são encaixados na membrana tilacoides. Este protocolo descreve um método básico para análise dos complexos proteína vegetal tilacoides de Arabidopsis thaliana com BN-página combinada com 2D-SDS-PAGE. O protocolo é também adequado para a análise de complexos de proteínas tilacoides de tabaco e espinafre contém, mas pode precisar de pequenos ajustes.

Para a solubilização do.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 6-aminocapróico (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sacarose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrilamida (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Cuidado: Neurotóxico!
n-dodecil-β-D-maltosídeo	Sigma-Aldrich	D4641
Tricina	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Uréia	VWR	28877.292
Glicerol	J.T. Baker	7044
Fluoreto de sódio (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA sal dissódico	J.T. Baker	1073
Digitonina	Calbiochem	300410	Cuidado: Tóxico!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoetanol	Bio-Rad	1610710
APS (persulfato de amônio)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetrametiletilenodiamina)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Metileno)-Bis-Acrilamida	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Marcador de Proteína Prestado, Ampla Gama (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Tubos de Centrífuga Cônicos 15 ml	Corning	352093
Rodízio de gel duplo com placas de 10 x 8 cm	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0,75 mm Espaçadores em T	Hoefer	SE2119T-2-.75
Pente de gel de amostra, 0,75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Sistema de eletroforese vertical Mighty Small SE250	Hoefer	SE250
Bomba IPC	Ismatec
Fonte de alimentação, Centrífuga PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813