Summary
ويصف هذا البروتوكول أسلوب المفاضلة بطانية لخلايا القلب السلف. لا سيما وهو يركز على كيف تؤثر على إمكانيات التمايز غشائي تركيز المصل وكثافة البذر الخلية.
Abstract
قد تكون الخلايا السلف القلب (Cpc) الإمكانات العلاجية لتجديد القلب بعد الإصابة. في قلب الثدييات الكبار، Cpc الجوهرية شحيحة للغاية، ولكن تكلفة النقرة موسعة يمكن أن تكون مفيدة للعلاج بالخلايا. شرطا مسبقاً لاستخدامها هو قدرتها على التفريق بطريقة الخاضعة للرقابة في الأنساب القلب المختلفة باستخدام بروتوكولات محددة وتتسم بالكفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، عند التوسع في المختبر ، Cpc المعزولة من المرضى أو نماذج المرض الإكلينيكية قد توفر أدوات البحث المثمر لتحقيق آليات المرض.
الدراسات الحالية استخدام علامات مختلفة لتحديد تكلفة النقرة. ومع ذلك، ليس كل منهم يعبر عن البشر، مما يحد من تأثير متعدية الجنسيات من بعض الدراسات الإكلينيكية. سوف تسمح البروتوكولات التمايز قابلة للتطبيق بغض النظر عن التعبير عزلة تقنية وعلامة لتوسيع موحدة وفتيلة Cpc لغرض العلاج خلية. هنا يصف لنا أن فتيلة من تكلفة النقرة تحت تركيز مصل بقرى الجنين منخفضة (FBS) وخلية منخفض الكثافة ظروف تسهل غشائي التفريق بين استخدام اثنين من الفئات السكانية الفرعية المختلفة من الماوس وفار Cpc-Cpc، نظهر أن laminin أكثر الركيزة مناسبة من فيبرونيكتين لهذا الغرض بموجب البروتوكول التالي: بعد استزراع عن 2-3 أيام في المتوسط بما في ذلك المكملات الغذائية أن الحفاظ على مولتيبوتينسي ومع 3.5% FBS، Cpc هي تبذر في لامينين في < التقاء 60% ومثقف في المتوسط خالية من الملحق بتركيزات منخفضة من FBS (0.1 ٪) لمدة 20-24 ساعة قبل التمايز في متوسطة التمايز بطانية. نظراً لتكلفة النقرة عدد سكان غير متجانسة، تركيزات مصل الدم ومرات الحضانة قد تحتاج إلى تعديلها تبعاً لخصائص يتدنى التصنيف الخاصة بكل منها. ونظرا لهذا، يمكن تطبيقها على أنواع أخرى من تكلفة النقرة، فضلا عن التقنية ويوفر وسيلة مفيدة للتحقيق في إمكانية وآليات للتمايز وكيف أنها تتأثر بالمرض عند استخدام Cpc معزولة عن نماذج المرض كل منهما.
Introduction
دعم الدراسات التي أجريت مؤخرا وجود خلايا السلف القلب المقيم (Cpc) في قلب الثدييات الكبار1،2،3، وتكلفة النقرة يمكن أن يكون مصدرا مفيداً لعلاج الخلايا بعد إصابة القلب4، 5-وباﻹضافة إلى ذلك، Cpc الموسعة قد تقدم نموذجا مثمرا لفحص المخدرات والتحقيق في آليات المرض عند معزولة من مرضى القلب نادرة، أو من المرض كل نماذج6،7.
Cpc معزولة عن قلب الكبار تمتلك الجذعية/السلف خلية الخصائص1،2،،من38 كما مولتيبوتينت، كلونوجينيك، ولديها القدرة على التجدد الذاتي. ومع ذلك، هناك العديد من السكان مختلفة (الفرعية) لتكلفة النقرة نستعرض الملامح ماركر السطحية المختلفة، بما في ذلك، على سبيل المثال، ج-كيت، 1 هيئة الأوراق المالية، وغيرها، أو استردادها بواسطة تقنيات العزل المختلفة (الجدول 1). وكانت عدة بروتوكولات الثقافة والتمايز المنشأة1،2،،من89،10،،من1112، 13،،من1415،16،،من1718. وتختلف هذه البروتوكولات معظمها يتعلق بعامل النمو ومحتوى مصل الدم، التي يتم تعديلها وفقا للغرض من استزراع والتي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في النتائج والنتائج، بما في ذلك كفاءة التمايز.
تقنيات العزل القائم على علامة:
Cpc يمكن عزل استناداً إلى علامة سطحية محددة تعبير1،2،،من89،10،11،12،13 ،14،،من1516،،من1718. تشير الدراسات السابقة إلى أن ج-كيت والهيئة-1 قد تكون علامات أفضل لعزل المقيم Cpc1،،من1114،،من1920. نظراً لأن أيا من هذه العلامات محددة حقاً لتكلفة النقرة، عادة ما يتم تطبيق تركيبات من علامات مختلفة. على سبيل المثال، حين Cpc التعبير عن مستويات منخفضة من مجموعة ج21، ج-كيت أيضا أعرب عن سائر أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا ماست22،23من خلايا بطانية، و الخلايا الجذعية المكونة للدم/السلف24. وهناك مشكلة إضافية هي حقيقة أن ليس كل علامات يتم التعبير عنها عبر جميع الأنواع. وهذا هو الحال بالنسبة للهيئة-1، الذي يعرب بالماوس ولكن ليس في الإنسان25. ولذلك، استخدام البروتوكولات التي تكون مستقلة عن علامات العزلة قد يكون من المفيد النظر إلى التجارب السريرية والدراسات باستخدام عينات بشرية.
تقنيات عزل علامة مستقلة:
وهناك العديد من التقنيات الرئيسية لعزل الحزب الشيوعي الصيني، التي هي أساسا مستقلة للتعبير علامة السطحية، ولكن التي يمكن صقلها بالتحديد على التوالي اﻷفخاذ علامة إيجابية محددة حسب الحاجة (انظر أيضا الجدول 1). (1) تقنية السكان (SP) الجانب اتسم أصلاً في عدد سكان بدائية من الخلايا الجذعية المكونة للدم استناداً إلى القدرة على افلوكس صبغ الحمض النووي هويشت 3334226 ملزم ATP كاسيت (ABC) الناقلين27. تم عزلة بواسطة مجموعات مختلفة القلب SP الخلايا وذكرت للتعبير عن مجموعة متنوعة من علامات مع بعض الاختلافات الطفيفة بين التقارير2،8،،من1314. (2) مستعمرة-تشكيل وحدة تنتجها الخلايا الليفية الخلايا (زيمبابوي-خ) أصلاً تم تعريفها على أساس في خلية stromal الوسيطة (MSC)-مثل النمط الظاهري. تستزرع MSCs معزولة عن الأطباق للحث على تشكيل مستعمرة. مثل مستعمرة-تشكيل لجنة السلامة البحرية مثل زيمبابوي-خ يمكن أن تكون معزولة عن قلب الكبار وهي قادرة على تفرق في الأنساب القلب15. (3) المستمدة من كارديوسفيري الخلايا (CDC) هي خلايا مفردة مشتقة من مجموعات من الخلايا التي نمت من خزعات الأنسجة أو اكسبلانتس28،29،،من3031. مؤخرا تبين أن معظمها CD105+/CD90 معارض جزء الخلية/c-kit– –كارديوميوجينيك والتجدد المحتمل32.
هنا، باستخدام SP-Cpc المعزولة من الفئران، نقدم بروتوكول لاستحثاث كفاءة النسب غشائي استناداً إلى دراسة سابقة في Cpc الجرذ والفأر SP-Cpc33. ويتضمن البروتوكول تعديلات محددة للثقافة وأسلوب التوسع فيما يتعلق بكثافة الخلية، ومحتوى مصل المتوسطة، والركيزة. فإنه يمكن تطبيقها ليس فقط على الماوس SP-Cpc ولكن للحصول على أنواع مختلفة من تكلفة النقرة لهذا الغرض لحفز التحول مصير من تضخيم للحزب الشيوعي الصيني غشائي المرتكبة، سواء كان ذلك نظراً لزرع هذه الخلايا أو استعمالها للدراسات الميكانيكية في المختبر .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
استخدام الماوس لغرض عزل الخلية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ومع "قانون حماية الحيوان السويسرية" وأقرته "سلطات الكانتونات السويسرية".
ملاحظة: عزل هيئة الأوراق المالية-1+/CD31– تم س-Cpc من قلب الماوس أساسا كما هو موضح سابقا34 مع إدخال بعض التعديلات عليها. للمواد والكواشف المستخدمة، انظر الجدول للمواد. لجميع التجارب، تضخم القلب SP-Cpc المعزولة من الفئران، باساجيد، وتستخدم بطريقة شبيهة بخط خلية. واستخدمت مقاطع من 7-20 لهذه الدراسة.
1-إعداد الأنسجة
ملاحظة: يجب إجراء جميع التجارب الفئران باستخدام وفقا للمبادئ التوجيهية والأنظمة. هذا البروتوكول يستخدم الفئران الأربعة. يتم وصف لوحات الثقافة التي 100 ملم في القطر P100 ولوحات الثقافة التي 60 ملم في القطر توصف P60 للأجزاء التالية من البروتوكول.
- حقن كل الماوس مع 200 مغ/كغ بينتوباربيتال إينترابيريتونيلي (القائمة) والانتظار حتى أنه هو تماما تخديره بالتحقق من ردها على أخمص القدمين معسر.
- مسح الصدر مع الإيثانول 70%. قطع الجلد وجدار الصدر مع مقص لفضح تجويف الصدر.
- رفع القلب بالملقط وقطع عليه في القاعدة باستخدام مقص. وضع القلب في P100 مع 25 مل (5 مل ل P60) من المياه المالحة الباردة مخزنة الفوسفات (PBS) (ثلاث إلى خمس قلوب كل P100) أو واحد إلى اثنين في قلوب كل P60.
- مضخة القلب بالملقط لإخراج الدم من التجاويف (الشكل 1A).
- وضع القلب في P100 مع 25 مل (5 مل ل P60) لبرنامج تلفزيوني الباردة للغسيل. إزالة الاذينين استخدام مقص صغير. قص القلب إلى قطعتين طولية ويغسل لهم مرة أخرى في برنامج تلفزيوني المثلج (25 مل/P100، 5 مل/P60).
- نقل القطع إلى P100 جديدة مع 25 مل (5 مل ل P60) لبرنامج تلفزيوني الباردة. قص القطع إلى أجزاء أصغر باستخدام مقص صغير (الشكل 1B). إضافة قطره من 1 ملغ/مل كولاجيناز ب المخفف في هانك لحل متوازن الملح (حبس) وفرم القطع الصغيرة جيدا بشفرة حلاقة معقم (الشكل 1).
2-الهضم
- إضافة 10 مل (2.5 مل ل P60) الحل ب كولاجيناز 1 ملغ/مل للطبق من الخطوة 1، 6.
- وضع الحل كولاجيناز ب التي تحتوي على قطع القلب مفروم في (حوالي 30°) يميل P100 (أو P60) في حاضنة 37 درجة مئوية (الشكل 1).
- احتضان القطع القلب المفروم لمدة أقصاها 30 دقيقة؛ مجانسة بتمرير لهم مرارا وتكرارا عن طريق ماصة باستور كل 10 دقائق أثناء الاحتضان (الشكل 1E).
ملاحظة: من المهم أن لا يتجاوز 30 دقيقة للحضانة في المجموع للخطوة 1، 3.
3-الترشيح
- إضافة 10 مل (5 مل ل P60) من هبس الباردة وتستكمل مع 2% FBS للقطع قلب مفروم والمتجانس.
ملاحظة: حبس وتستكمل مع النشاط كولاجيناز ب 2% FBS يروي. - تصفية قطع القلب من خلال 100 ميكرومتر تصفية لإزالة الأنسجة عسر الهضم، وأجهزة الطرد المركزي في 470 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) (الشكل 1F، مرشحات الأصفر).
- تجاهل المادة طافية ريسوسبيند بيليه في 5 مل (3 مل ل P60) من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء، واحتضان بيليه لمدة 5 دقائق مع الهز عرضية على الجليد.
- إضافة 10 مل (5 مل ل P60) من برنامج تلفزيوني (لوقف رد الفعل تحلل) وتصفية العينة من خلال عامل تصفية 40 ميكرومتر استبعاد الخلايا الكبيرة، بما في ذلك كارديوميوسيتيس المتبقية (الشكل 1F، مرشحات الأزرق).
- الطرد المركزي الأنبوب في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت (دون الفرامل). تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل دميم بما في ذلك 10% FBS.
- عد الخلايا في قاسمة مع هيموسيتوميتير. ريسوسبيند الخلايا مع دميم بما في ذلك 10% FBS، يهدف إلى تركيز خلية الأخيرة من 1 × 106 خلايا/مل.
ملاحظة: تقريبا 5 × 106 خلايا كارديوميوسيتي وكرات الدم الحمراء المستنفد يمكن تقدير كل الماوس. - توزيع الخلايا في أنابيب اثنين (الشكل 2): في الأنبوب A، قم بإضافة 1.5 مل لتلطيخ هويشت 33342 مع فيراباميل؛ في الأنبوب ب، إضافة مل 18.5 لتلطيخ هويشت 33342 والمضي قدما لوصمة عار وفرز الخلايا س القلب (خطوات 4.1 و 4.2) بالتدفق الخلوي.
4-فرز الخلايا س القلب بالتدفق الخلوي
ملاحظة: يمنع فيراباميل efflux هويشت بحجب عصيات مقاومة نشاط الناقل ABC (المقاوم). هويشت 33342 هو صبغة الحمض النووي ملزمة التي يمكن استخدامها للكشف عن دورة الخلية، كما أنه يرتبط بمحتوى الحمض النووي في الخلايا الحية. تظهر الخلايا هويشت-33342-البثق في الجزء المنخفض هويشت من كلتا القناتين الانبعاثات (450 نانومتر، الأزرق هويشت؛ 650 نانومتر، الأحمر هويشت)، جانبا هويشت-الإبقاء على "السكان الرئيسية"، منحهم اسم "الجانب سكانها". حزمة الخدمة SP الخلايا التي أثرت في الخلايا التي تحتوي على خصائص السلف وإظهار تعبير عالية من الناقلين ABC المقاوم للأدوية المتعددة (مثل MDR1 و ABCG2). هويشت 33342 مكتوبة هويشت للأجزاء التالية من البروتوكول. من المهم أن تحمي مواد حساسة للضوء لنتائج مثالية.
-
تلطيخ مع هويشت في وجود وغياب فيراباميل
- إضافة فيراباميل (بتركيز نهائي من 83.3 ميكرومتر) وهويشت (مع تركيز نهائي من 5 ميكروغرام/106 خلايا) في حل الخلية. استخدام أنبوب A، فيراباميل وهويشت؛ الأنبوبة ب، استخدم هويشت فقط. احتضان في حمام مائي (عند 37 درجة مئوية) لمدة 90 دقيقة، وتعود هذه الأنابيب كل 20 دقيقة (الشكل 1).
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت تجاهل المادة طافية وريسوسبيند كل بيليه في حبس (1 × 106 خلايا/مل).
- تتخذ من 1.5 مل الكوة ستينينجس واحدة والمراقبة السلبية من الأنبوب ب (الشكل 2): (ط) fluorescein isothiocyanate (فيتك)-مترافق مكافحة-الهيئة-1؛ (ثانيا) اللوفيكوسيانين (APC)-مترافق مكافحة--CD31؛ (ثالثا) نونستينيد الخلايا (مراقبة سلبية).
ملاحظة: يتم استخدام عناصر تحكم ايستب هنا لإعداد بروتوكول العزلة. - الطرد المركزي أنابيب A و B ومختبرين التحكم تلطيخ واحدة وسلبية في 470 x ز لمدة 5 دقائق في RT للغسيل هويشت وفيراباميل.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الكريات من الأنبوب A و (الثالث) مراقبة سلبية في 250 ميليلتر من حبس وإبقائهم على الجليد في الظلام حتى الفرز.
- ريسوسبيند بيليه من الأنبوب ب 200 ميليلتر من حبس وبيليه (الأول والثاني) من مختبرين تلطيخ واحد في 100 ميليلتر من حبس. إضافة فيتك مترافق مكافحة-الهيئة-1 (0.6 ميكروغرام/107 الخلايا) والجيش الشعبي الكونغولي مترافق مكافحة--CD31 (0.25 ميكروغرام/107 الخلايا). احتضان الكريات لمدة 30 دقيقة على الجليد ويهز لهم من وقت لآخر في الظلام.
- إضافة 2 مل هبس للأنابيب. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند جميع الكريات مع 1 مل من حبس وأجهزة الطرد المركزي كما أعلاه. تجاهل في سوبيرناتانتس. ريسوسبيند بيليه مختبرين تلطيخ واحد في 200 ميليلتر من هبس. ريسوسبيند بيليه من الأنبوب ب في حبس (20 × 106 خلايا/مل).
- تبقى العينات على الجليد ومحمية من الضوء حتى الفرز.
-
الفرز مع التدفق الخلوي
- إعداد معقم مل 1.5 فرز أنابيب مع 500 ميليلتر من حبس بما في ذلك 2% FBS.
- وصمة عار في الخلايا التي تحتوي على 7-أمينواكتينوميسين د (7-عاد) (0.15 ميكروغرام/106 خلايا) على الجليد لمدة 10 دقائق لاستبعاد الخلايا الميتة.
- فرز SP القلب باستخدام الإعدادات التالية: تثير هويشت استخدام 350 نانومتر (الأشعة فوق البنفسجية) الإثارة وجمع الانبعاثات الأسفار مع مرشح تمرير نطاق شمال البحر الأبيض المتوسط 450/50 (هويشت الأزرق) ومرشح تمرير فرقة 670/30 نانومتر (هويشت الأحمر)، واستخدام حجم فوهة من 100 ميكرومتر والضغط من 15 رطل/بوصة مربعة.
- للتحليل وتسجيل أحداث5 5 × 10 لفرز العينات وأحداث5 1 × 10 للمراقبة السلبية والتحكم فيراباميل، وتلطيخ واحد العينات.
ملاحظة: القلب SP حوالي 0.5%-2% (الشكل 1 ح) ولكن قد تختلف بين المختبرات ويعزل. /CD31 هيئة الأوراق المالية-1+كسر– حوالي 1%-11% SP القلب مجموع (1I الشكل) ولكن قد تختلف بين المختبرات ويعزل. هيئة الأوراق المالية-1+/CD31– SP-Cpc مكتوبة ك SP-Cpc للأجزاء التالية من البروتوكول.
5-الابتدائي ثقافة معزولة SP-Cpc
ملاحظة: استخدمت ثلاثة أنواع مختلفة من وسائل الإعلام في هذا البروتوكول. يشار إليها متوسطة 1 (وفقا نوسيدا et al.) 8, 2 المتوسطة، و 3 المتوسطة وهي الموصوفة في الجدول للمواد المتعلقة بتكوينها.
- الاحماء متوسطة 1 إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام وتبريد أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية. الطرد المركزي فرز أنابيب في 4 درجات مئوية و 470 x ز لمدة 6 دقائق وريسوسبيند الخلايا في المتوسط 1.
- وضع الخلايا على طبق P60 غاز نفاذية مع 4 مل من 1 المتوسطة. تغيير المتوسطة كل 3 د حتى وصلت الخلايا التقاء 70% إلى 80%.
ملاحظة: الخطوة 5.2 قد يستغرق حوالي 2-3 أسابيع.
6-توسيع وتمايز SP-Cpc
-
خلية ثقافة
- ثقافة 3 × 105 س-Cpc في 8 مل من 1 المتوسطة في قارورة T75.
- احتضان SP-Cpc في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 حتى التقاء 70% إلى 80%، التغير المتوسط كل 2-3 د.
ملاحظة: ينبغي تعديل عدد الخلايا وفقا لنوع Cpc المستخدمة والوقت مضاعفة حجم الخلية.
-
س--الحزب الشيوعي الصيني النمو والبقاء تحت تركيزات مصل مختلفة
- الثقافة SP-Cpc لمد 2-3 في قوارير T75 مع مل 8 1 المتوسطة. نضح المتوسطة وشطف بلطف مع 5 مل الحارة (37 درجة مئوية) حبس بعناية.
- علاج الخلايا مع 5 مل يدتا التربسين لمدة 5 دقائق في الخلية الحاضنة وإضافة 5 مل من 1 المتوسطة وقف النشاط التربسين، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي الخلايا في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
- ريسوسبيند الخلايا في متوسطة 1 أو 2 المتوسطة (النسب المتوسطة التعريفي) ولوحة 2.5 × 105 SP-Cpc الأطباق P60 مع 3 مل متوسطة التي تحتوي على تركيزات مختلفة من المصل.
- جمع المتوسطة من طبق الخطوة 6.2.4 لجمع الخلايا الميتة في أنبوب 15 مل بعد 2 (د) من استزراع في المتوسط 1 أو 2 متوسطة.
- تريبسينيزي الخلايا ملتصقة كما في الخطوة 6.2.2 وجمع تعليق خلية في أنبوب 15 مل الخطوة 6.2.5. الطرد المركزي الخلايا في x 840 ز لمدة 5 دقائق في الرايت
- نضح المادة طافية وإضافة 1 مل من متوسطة 1 أو 2 متوسطة لخلية العد. وصمة عار SP-Cpc تريبان الأزرق (0.4 في المائة) والكونت تريبان الأزرق-إيجابية (الميت) وتريبان الأزرق سالب الخلايا (قابلة للتطبيق).
ملاحظة: صلاحية خلية (الخطوة 6.2.7) تعطي كعدد الخلايا تريبان الأزرق السلبية فيما يتعلق بعدد إجمالي الخلايا.
-
التعريفي للتمايز غشائي
- بركات صفيحة ثقافة (6-جيد) مع 10 ميكروغرام/مل لامينين (LN) أو فيبرونيكتين (الجبهة الوطنية).
- جعل حلاً الركيزة التي تحتوي على 10 ميكروغرام/مل LN أو FN مع F12 المتوسطة (أو برنامج تلفزيوني). إضافة 2 مل من محلول الركازة لكل بئر. الحفاظ على اللوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- نضح الحل من اللوحة وإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر حتى استخدامه.
- نضح المتوسطة من الخلايا من الخطوة 6.1.2 وشطف لهم بلطف مع 5 مل الحارة (37 درجة مئوية) حبس وتعاملهم مع 5 مل يدتا التربسين لمدة 5 دقائق في الخلية الحاضنة، وإضافة 5 مل من 1 المتوسطة لوقف نشاط التربسين ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي الخلايا في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت أسبيراتي المادة طافية وإضافة 2 المتوسطة لخلية العد.
- البذور 8 × 104 خلايا كل جيدا على لوحة المغلفة مع 3 مل من 2 المتوسطة وإبقائه في 37 درجة مئوية ل 20-24 حاء – التغير المتوسط إلى 3 مل من 3 المتوسطة.
ملاحظة: من المستحسن استخدام المتوسطة التي تحتوي على تركيز مصل منخفضة – ودون ملاحق – لأول ح 20-24. ننصح باستخدام < التقاء خلية 60% (أيعدد الخلايا من الخطوة 6.3.4 يجب أن يعدل تبعاً لمعدل حجم ونمو الخلية). - الثقافة الخلايا لمد 21 وتغير متوسط كل 3 د.
- التحقق من طبيعة غشائي الخلايا المتمايزة تلطيخ لهم مع علامة غشائي مثل فون ويليبراند المنفذ fluorescence مجهرية وعامل (فوف).
- تغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا في فورمالدهايد 3.7% لمدة 2 دقيقة في الرايت
- بيرميبيليزي الخلايا مع 0.1% X تريتون في ddH2س (أو برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة ومنعه مع 10% مصل الماعز ح 1 في الرايت
- احتضان الخلايا مع مكافحة فون ويليبراند عامل جسم (1: 100) ح 48 عند 4 درجة مئوية
- تغسل الخلايا 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، لمدة 10 دقائق في كل مرة. احتضان لهم مع أليكسا فلور 546 الماعز الأرنب المضادة الأجسام المضادة الثانوية (1: 500) ح 1 في RT في الظلام.
- أغسل x 3 مرة أخرى، لمدة كل منها 10 دقائق مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. وصمة عار نواة الخلية مع 4 ' 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، هيدروكلوريد (DAPI؛ 1: 500) لمدة 5 دقائق في RT في الظلام.
- تغسل الخلايا 3 x، لمدة 5 دقائق في كل منهما، مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. جبل الخلايا وتخزينها في 4 درجات مئوية
ملاحظة: شروط الخطوات 6.1 و 6.3 تثقيف (الركيزة والمتوسطة والمواد الكاشفة تكميلية وتركيز FBS) يرد في الشكل 3.
- بركات صفيحة ثقافة (6-جيد) مع 10 ميكروغرام/مل لامينين (LN) أو فيبرونيكتين (الجبهة الوطنية).
-
أنبوب تشكيل الإنزيم
- إعداد مصفوفة لغشاء (مثلاً، ماتريجيل، يشار إليها من الآن فصاعدا مصفوفة) لوحة.
- ذوبان الجليد المصفوفة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- معطف صفيحة 96-جيدا مع 100 ميليلتر من المصفوفة على الجليد.
ملاحظة: من المهم تجنب أي فقاعات في المصفوفة. اللوحات يجب أن تكون مغلفة بالثلج لتفادي جيليفيكيشن المصفوفة. - الحفاظ على اللوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- نضح المتوسطة من الخلايا (بعد انتهاء الخطوة 6.3.5) ولطف شطف الخلايا مع 5 مل الحارة (37 درجة مئوية) حبس، وتعاملهم مع التربسين يدتا لمدة 5 دقائق في الخلية الحاضنة. أضف 3 المتوسطة لوقف النشاط التربسين ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل.
- الطرد المركزي الخلايا في 470 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت أسبيراتي المادة طافية، أضف 1 مل 3 المتوسطة، وبيبيت بلطف.
- تصفية الخلايا مع مصفاة خلية 35 ميكرون، إذا كان يتم تجميع الخلايا.
- عد الخلايا والبذور 2 × 103 إلى 4 × 103 خلايا في 100 ميليلتر من متوسطة 3 في كل مصفوفة المغلفة بشكل جيد. تبقى اللوحة عند 37 درجة مئوية في الخلية الحاضنة ح 16.
- التقاط صورة مجهر مشرق الميدان الساعة 2 X التكبير.
ملاحظة: في حالة تريبسينيزيشن غير مكتملة، إطالة وقت التعرض إلى التربسين-يدتا بحد أقصى 7-8 دقيقة.
- إعداد مصفوفة لغشاء (مثلاً، ماتريجيل، يشار إليها من الآن فصاعدا مصفوفة) لوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عزل SP-الحزب الشيوعي الصيني الماوس:
في هذه الدراسة، قمنا باستخدام الماوس Cpc المعزولة وفقا النمط الظاهري SP، بينما يتم تعديل النتائج من الفئران Cpc وأضيف من تقرير سابق مع الإذن (الشكل 8)33.
تكاثر الخلايا تحت خلية عالية ومنخفضة الكثافة ومع تركيزات مصل الدم المختلفة:
وأظهرت دراستنا السابقة أن تغير التعبير مرناً من علامات النسب القلب داخل ح 24 أول استزراع خطوة. ومن المعروف أن المصفوفة خارج الخلية يؤثر على قرارات مصير الخلية، بما في ذلك التمايز غشائي35. لاستكشاف الظروف الملائمة لتسهيل التزام النسب غشائي Cpc، استخدمنا الجبهة الوطنية، وقانون الجنسية (كل 10 ميكروغرام/مل) في لوحة 6-جيدا (منطقة النمو: 9.6 سم2/جيد) في هذه الدراسة. لأن قرارات مصير دورة الخلية والخلية ترتبط ارتباطاً وثيقا، ونحن نسعى بشرط أن يسلك بمعدل انتشار منخفض خلية في غياب موت الخلية، على هذا النحو قد تعكس شرط الانتقال من تكاثر الخلايا إلى التمايز. أننا، لذلك، تطبق الشروط التالية ومقارنة معدلات انتشار الخلايا: لكثافة الخلايا وكونفلوينسي عالية (80%-90%) والمنخفضة (< 60%) كونفلوينسي، ومن أجل تركيز المصل، شروط الثقافة العادية (في هذه الدراسة 3.5% FBS) والمصل منخفضة الشروط (≤0.1% FBS). أولاً، قمنا باختبار الشرط الخلية منخفضة الكثافة. لا توجد هناك فروق كبيرة لبقاء الخلية والانتشار في الخلية منخفض الكثافة بنسبة 3.5 في المائة FBS بين قانون الجنسية والجبهة الوطنية، بينما كثافة خلية منخفضة مع 0.1% FBS تظهر تكاثر خلية انخفض في قانون الجنسية مقارنة بالجبهة الوطنية ولكن أي زيادة في موت الخلايا ( 4 الشكل). على النقيض من ذلك، أظهرت تركيزات المصل من 3.5 في المائة و 0.1% ظروف الخلية عالية الكثافة، لا اختلافات في انتشار الخلية وموت الخلايا بين ركائز اثنين (الشكل 5).
تشير هذه النتائج إلى أن كثافة خلية منخفضة في قانون الجنسية مع المصل 0.1% يقلل انتشار دون التأثير على استمرارية الحزب الشيوعي الصيني.
تغييرات في شكل الخلية في الأجلين المتوسط والتمايز بطانية:
على الرغم من أن تتطلب المزيد من الدراسات لفهم مغزى والآليات الكامنة، تظهر التغييرات على شكل خلية لتكون مؤشرا لشروط الثقافة مناسبة كتغييرات محددة يمكن ملاحظتها في وقت مبكر في الثقافات، التي غشائي المفاضلة ستكون ناجحة (الشكل 6). كما هو موضح في دوائر متقطع بيضاء في الشكل 6، ضمن 7-14 د في الأجلين المتوسط والتمايز بطانية، الواردة الناجحة الثقافات الخلايا التي كانت أكبر حجماً ومختلفة في التشكل إلى خلايا أخرى. من المثير للاهتمام، اختفى نهاية مرحلة تمايز هذه الخلايا وكما ظهر في عدد أقل، وفي نقاط زمنية لاحقة في الثقافات عالي الكثافة في قانون الجنسية و FN. في حين أننا لا تميز كذلك هذه الخلايا، ويقترح هذا البروتوكول تتبع الشكل الخلية كل د 2-3 حتى حوالي 14 يوم. في حالة ظهور لا من هذه الخلايا، ينبغي تخفيض عدد الخلايا في المصنف.
-تقييم قدرة غشائي مع مقايسة تشكيل أنبوب:
فحص تكوين أنبوب تقنية مفيدة لتقييم كفاءة التفريق بين غشائي Cpc بقياس قدرة أنبوب تشكيل خلايا متمايزة. لذلك، نحن، إجراء المقايسة تشكيل أنبوب مع خلايا متباينة وفقا للشروط الموصوفة. من المثير للاهتمام، استمرار قد ظهر تشكيل أنبوب ناجحة بالخلايا مطلي في الكثافة السكانية المنخفضة ومتباينة في قانون الجنسية، بينما فشل تشكيل أنبوب معظمها في الخلايا مطلي في قانون الجنسية في كثافة عالية (الشكل 7 أ). وبالمثل، تشكيل أنبوب كان معظمها غير ناجحة في الخلايا المستزرعة في الجبهة الوطنية بغض النظر عن كثافة الخلية، على الرغم من أن الخلايا المتمايزة في الجبهة الوطنية في كثافة منخفضة في بعض الأحيان تشكل أنابيب بدائية، تبعاً لحالة خلية (مثلاً، عزل و/أو ممر رقم 7B الشكل). للتأكد من طبيعة غشائي الخلايا، متباينة وفقا لبروتوكول وصف الخلايا مطلي في كوفيرسليبس والملون فوف. مرة أخرى، كان التعبير vWF أكثر تجانساً وأكثر وضوحاً في Cpc متباينة في قانون الجنسية مقارنة بالجبهة الوطنية (الشكل 7، د). يبين الشكل 8 وصف النتائج من مقايسة تشكيل أنبوب كإجراء للدراسات السابقة باستخدام Cpc الفئران تحت نفس البروتوكول كما هنا33. تظهر هذه النتائج أن تشكيل أنبوب أكثر كفاءة في خلايا متباينة في قانون الجنسية بالمقارنة مع الجبهة الوطنية عند مطلي بظروف الخلية منخفضة الكثافة ومع المصل منخفضة (0.1% FBS) ح 20-24 قبل التمايز في متوسطة التمايز بطانية. هذه النتائج تشير إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن تكون مفيدة لمختلف أنواع الخلايا ومستقلة عن الأنواع.
رقم 1: رسم توضيحي لعزل محددة الخطوات للحصول على تعليق خلية كارديوميوسيتي المستنفد من قلوب الماوس معزولة وتدفق الممثل قراءات الخلوي من sp. القلب (أ) هذا الفريق يظهر الإخراج من بقايا الدم من تجاويف القلب من خلال تكرار ضغط طفيف المطبقة باستخدام الملقط الصغيرة. (ب) هذا الفريق يظهر قطع القلوب إلى قطع صغيرة باستخدام مقص صغير. (ج) هذا الفريق يظهر تنميق القطع القلب باستخدام شفرة حلاقة. (د) هذا الفريق يظهر في حضانة قلوب مفروم مع كولاجيناز ب في ألواح مائلة عند 37 درجة مئوية. (ه) هذا الفريق يظهر تجانس قلوب المفروم باستخدام ماصة باستور من خلال الخطوة حضانة. (و) يظهر هذا الفريق تصفية الأنسجة هضمها من خلال عامل تصفية 100 ميكرومتر (أصفر) وتصفية 40 ميكرومتر (أزرق) لإزالة بقايا الأنسجة عسر الهضم وكارديوميوسيتيس. (ز) يظهر هذا الفريق عكس أنبوب 50 مل مخروطية الشكل الذي يحتوي على تعليق خلية كارديوميوسيتي المنضب والتفاف في إحباط القصدير لحماية خفيفة بعد إضافة هويشت لطيف. (ح) هذا الفريق يظهر التدفق الممثل قراءات الخلوي للخلايا الملون هويشت في وجود وغياب فيراباميل مثبطات الناقل ABC لتحديد sp. (أنا) يظهر هذا الفريق قطعة دوت ممثل SP الخلايا وفقا للايجابية CD31 وهيئة الأوراق المالية-1 للتعرف على/CD31 هيئة الأوراق المالية-1+– فخذ القبيلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نظرة عامة التخطيطي لإعداد نموذج المؤدية إلى الفرز SP القلب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: بروتوكول لتحريض النسب بطانية والتمايز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: انتشار الماوس SP-الحزب الشيوعي الصيني عند مطلي في كثافة خلية منخفضة تحت تركيزات المصل المختلفة في قانون الجنسية و FN. (أ و ب) وتظهر هذه اللوحات أرقام الخلية في يوم 2. (ج ود) هذه اللوحات إظهار الجدوى في اليوم الثاني. وترد البيانات ك ± يعني الخطأ المعياري للوسط (SEM)؛ N = 5؛ مقاطع مختلفة؛ ف < 0.05 من الطالب t-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: انتشار الماوس SP-الحزب الشيوعي الصيني عند مطلي في كثافة عالية خلية تحت تركيزات المصل المختلفة في قانون الجنسية و FN. (أ و ب) وتظهر هذه اللوحات أرقام الخلية في يوم 2. (ج ود) إظهار هذه الألواح استمرارية في اليوم الثاني. وترد البيانات ك ± يعني وزارة شؤون المرأة؛ N = 5؛ مقاطع مختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: خلية مورفولوجيا في 14 و 17 د أثناء عملية التمايز. يعرض هذا الشكل مشرق الميدان (BF) صور للماوس SP-Cpc المصنف على الأطباق المغلفة LN أو FN مع مستوى منخفض (منخفضة) أو بكثافة عالية (عالية) خلية، ومع متوسط 2 ح 20، تليها 3 المتوسطة لدال 14 أو 17 الأبيض علامة متقطع دوائر المناطق التي تحتوي على خلايا مستدير فيت (ح) خلية أكبر حجماً. وأجرى التصوير مع الفحص المجهري مشرق الميدان. التكبير = 2 X؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: أنبوب تشكيل وتلطيخ بعد التفريق بين غشائي SP-Cpc في قانون الجنسية و FN. فوف (أ و ب) وتظهر هذه اللوحات تشكيل الأنبوبة. (ج ود) وتظهر هذه اللوحات تلطيخ vWF. الخلايا كانت تبذر في 10 ميكروغرام/مل من الأطباق المغلفة LN أو FN مع كثافة خلية منخفضة أو عالية ومتوسطة 2 ح 20، تليها 3 المتوسطة لمد 21، ثم تحصد مع التربسين وتبذر في المصفوفة الغشاء. وقد اتخذت جميع الصور بعد ح 16. أجرى التصوير مع الفحص المجهري مشرق الميدان والتكبير = 2 X للوحات A و B. يتم إجراء التصوير مجهر فلوري والتكبير = 10 X للوحات ج ود. تظهر لوحات ألف و جيم الأطباق المغلفة بقانون الجنسية. وتظهر اللوحات ب ود الأطباق المغلفة بالجبهة الوطنية. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: أنبوب تشكيل بعد التفريق بين غشائي Cpc الفئران. كانت تبذر Cpc الفئران في كثافة منخفضة خلية على 10 ميكروغرام/مل من الأطباق المغلفة LN أو FN مع المتوسطة المحتوية على FBS F12 0.1% ح 20، تليها د 21 آخر في المتوسط 3، وتحصد ثم مع التربسين. على المصفوفة غشاء الطابق السفلي على لوحة 96-جيدا، كان المصنف 4 × 104 خلايا في 100 ميكروليتر من 3 المتوسطة. وأجرى التصوير مع الفحص المجهري مشرق الميدان. التكبير = 2 X؛ شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يتم تعديل هذا الرقم استناداً دراسة سابقة33. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الأنواع | العزلة، والكشف عن علامة | مرجع |
| الإنسان والفئران، الماوس | ج-طقم+/Lin-،/CD45 ج-كيت+-،/CD45 ج-كيت+/CD31–– | بلترامي، 2003 الخلية؛ بولي، انسيت 2011؛ أليسون، خلية 2013؛ سميث، نات بروتوك 2014؛ فيسينانزا، وموت الخلايا تختلف 2017 |
| الكلاب مهجنة | لين-، بالإضافة إلى: ج-كيت+، MDR1+ أو هيئة الأوراق المالية-1+ | لينكه، 2005 المحميات |
| الماوس | هيئة الأوراق المالية-1+ | أوه، 2003 المحميات |
| الماوس | الجانب السكاني، بالإضافة إلى: Abcg2+، هيئة الأوراق المالية-1+/CD31-،/PDGFRa هيئة الأوراق المالية-1++ | هييرليهي، فيبس ليت عام 2002؛ مارتن، ديف بيول 2004؛ فيستر، Circ Res عام 2005؛ نوسيدا، نات المشتركة عام 2015 |
| الماوس | مستعمرة تشكيل وحدة-تنتجها الخلايا الليفية، بالإضافة إلى: CD45-، CD31-، هيئة الأوراق المالية-1+، PDGFRa+ | بيليكانوس، الجذعية خلية Res 2012 |
| الماوس، الجرذان، والإنسان | 1-Isl+ *، بالإضافة إلى: CD31-، ج-كيت-، هيئة الأوراق المالية-1-، Gata4+، Nkx2.5+ | لاوجويتز، طابع عام 2005؛ بو، الطبيعة 2009 |
| * Isl-1 يرد في عضلة القلب الجنينية أو الأجنة، لا في قلب الكبار. | ||
الجدول 1: علامات لخلايا القلب السلف وتقنيات العزل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مزايا هذا البروتوكول:
يوفر هذا البروتوكول أسلوب المفاضلة بطانية لتكلفة النقرة. ووجدنا أن تركيز المصل منخفضة، والخلية منخفضة الكثافة يمكن تحسين كفاءة التمايز بطانية، حيث ثبت LN الركازة أكثر ملاءمة من الجبهة الوطنية في ظل هذه الظروف. استخدمنا نوعين متميزين من تكلفة النقرة: الفئران Cpc، التي استخدمت بطريقة شبيهة بخط الخلية، والماوس SP-Cpc، التي كانت معزولة وتوسيعها. جدير بالذكر أن البروتوكول تنطبق على كلا النوعين Cpc. الحالية تسمح التقنيات العلماء عزل وتوسيع Cpc الأولية من الفئران المحورة وراثيا ومن نماذج الأمراض السريرية، وكذلك من البشر28،36. باستخدام هذا البروتوكول على Cpc معزولة يمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في آليات المرض ليس فقط ولكن أيضا لاستكشاف الأهداف العلاجية الرواية.
Cpc حاليا في التجارب السريرية لخلية العلاج4،5، حيث الخلايا المعزولة من المرضى وزرع مرة أخرى بعد التضخيم في المختبر . وفي هذا الصدد، يمكن أن يساعد البروتوكول المعروضة هنا تحديد الاستراتيجيات الرامية إلى تعزيز إمكانيات التمايز هذه Cpc قبل الزرع. ومع ذلك، خلية العلاج لا يزال يعاني من فعالية محدودة بسبب الاحتفاظ بها منخفضة وبقاء انجرافتمينت لزرع خلايا. الميكانيكية في المختبر الدراسات استناداً إلى هذا البروتوكول أو التكييف منها لديها القدرة على الإسهام في فهم أفضل للآليات الجزيئية التي يقود العملية التمايز في آليات خاصة، تتصل بكثافة الخلية ، الركيزة، وعوامل النمو. قد يكون في نهاية المطاف المستخدمة لإعادة برمجة الخلية المعارف الجديدة التي تم استردادها من هذه الدراسات وتطبيقها على تؤثر تأثيراً مباشرا على Cpc المقيم للتفريق بعد الإصابة.
القيود المفروضة على هذا البروتوكول:
Cpc الأولية المعزولة من السكان غير المتجانسة التي تظهر تعمل مختلفة فيما يتعلق بحجم الخلية ومعدل نمو الخلية تبعاً للعزلة، حتى عند استخدام نفس علامات وتقنية عزل متطابقة. ولذلك، النقاط الثلاث التالية تحتاج إلى تعريف: بذر الخلية (1) الأرقام وفقا لحجم الخلية، (2) تركيز المصل مثالية (< 0.5%)، ووقت الحضانة (3) الخطوة الأولى (تنظيم دورات تعريفية للنسب) مع تركيز مصل منخفضة جداً. هنا، نحن إظهار الاختلافات في الكفاءة التمايز اعتماداً على كثافة الخلية. بيد على الرغم من أننا مقارنة المصل منخفضة (0.1% FBS) مقابل ثقافة مصل تركيزات (3.5% FBS)، أننا لم تنظر في تجمعات أخرى داخل < 0.5% FBS النطاق. وباﻹضافة إلى ذلك، اعتماداً على علامات العزلة المستخدمة والأنواع، قد تختلف كفاءة الحث الالتزام بالنسب. ولذلك، ينبغي أن يكون البروتوكول الأمثل لكل نوع من الخلايا.
يمكن استخدام تقنيات توجيهيا تثبيط الدوائية والوراثية لدراسة آليات المرض مع هذا البروتوكول، بدلاً من الكائنات المعدلة وراثيا أو نماذج الأمراض الحيوانية. في هذه الحالة، ينبغي أن تكون إعادة تصميم البروتوكول: قبل العلاج مع المتوسطة التي تحتوي على المصل منخفضة، سيتم التعامل مع الخلايا مع الكواشف محددة أو الأدوات الجينية. نتيجة لذلك، قد تكون الخلايا أكثر ضعفا من الخلايا نونتريتيد. استخدام المصل منخفضة في الخطوة الأولى هي النقطة الرئيسية في هذا البروتوكول. ولذلك، عملية التحقق دقيق من مصل تركيز وحضانة وقت الخطوة الأولى للسماح لإبطاء انتشار الخلايا مع الحفاظ على استمرارية تحت الحرمان المصل أمر بالغ الأهمية لما إذا كان هذا البروتوكول يمكن نجاح أم لا.
موجز:
باختصار، توفر Cpc معزولة من نماذج حيوانية أداة قيمة لدراسات الأمراض وتجديد القلب. عند توسيع، Cpc البشرية قد أيضا يمكن استخدامها مباشرة للعلاج بالخلايا. نحن، هنا، تقديم بروتوكول لتحريض كفاءة النسب بطانية والتفريق بين Cpc استناداً إلى التعديلات حذراً من تركيزات مصل الدم وكثافة الخلية. وميزة هذا البروتوكول هو انطباقه على أنواع مختلفة من تكلفة النقرة وإمكاناته للمساهمة أساسا للدراسة و/أو إنشاء أدوات إنعاش القلب رواية أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون لورينز فيرا للدعم المفيد الذي قدمته خلال التجارب والموظفين من "مرفق التدفق الخلوي" من إدارة الطب الحيوي (DBM) وجامعة بازل في مستشفى الجامعة. وأيد هذا العمل البقاء في مسار البرنامج من جامعة بازل (موشيزوكي ميتشيكا). م. غابرييلا كوستر معتمد بمنحه من "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية" (المنحة رقم 310030_156953).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% for lineage induction) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Final concentration 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endothelial differentiation | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Dilute in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Diluite 1:10 in PBS (3.7% final concentration) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% goat serum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% goat serum |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Tube formation | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml Round Bottom Tube with Strainer Cap | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolation34 | |||
| Reagents | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml ad usum vet. | in house hospital pharmacy | #9077862 | Working solution: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), phenol red (-) | ThermoFisher | #14175 | Prepare HBSS 500 mL + 2% FBS for quenching Collagenase B activity |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L of D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvate | ThermoFisher | #331885 | Prepare DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S for Hoechst stanining |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Final concentration 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Dilute to 1X in ddH2O and filter through a 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Final concentration 1 mg/mL in HBSS, filtered through a 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Prepare 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Final concentration 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cells |
| 7-Aminoactinomycin D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cells |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cells |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107cells |
| Material | |||
| Needles 27G | Terumo | #NN-2719R | |
| Needles 18G | Terumo | #NN-1838S | |
| Single Use Syringes 1 mL sterile | CODAN | #62.1640 | |
| Transferpipette 3.5 mL | Sarstedt | #86.1171.001 | |
| Cell Strainer 40 µm blue | BD Biosciences | #352340 | |
| Cell Strainer 100 µm yellow | BD Biosciences | #352360 | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | #94.6077.305 | |
| Culture Dishes P100 | Corning | #353003 | |
| Culture Dishes P60 | Corning | #353004 | |
| Mouse | |||
| Line | Age | Breeding | |
| C57BL/6NRj / male | 12 weeks | in house | |
| Product Name | Company | Catalogue No. | |
| Reagents | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Switzerland | #100-125 | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Overview of medium compositions. Some of this infomation is identical with the one provided above, but sorted according to the composition of Media 1-3. | |||
| Product Name | Medium 18 | Medium 2 | Medium 3 |
| Reagents | Culture | Lineage induction | Endothelial diff. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | 35% | 35% | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | 65% | 65% | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | 1% | 1% | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 3.5% | ≤0.1% | |
| L-Glutamine | 2 mM | 2 mM | |
| Glutathione | 0.2 nM | 0.2 nM | |
| B27 Supplement | 1.3% | ||
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | 6.5 ng/mL | ||
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | 13 ng/mL | ||
| Cardiotrophin 1 | 0.65 ng/mL | ||
| Thrombin | 0.0005 U/mL | All necessary components included in the kit | |
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | All necessary components included in the kit |
References
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population. FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).
- Sandstedt, J., et al. Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells. Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132 (4), 537-543 (2008).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).
- Noseda, M., et al. PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium. Nature Communications. 6, 6930 (2015).
- Linke, A., et al. Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).
- El-Mounayri, O., et al. Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).
- Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154 (4), 827-842 (2013).
- Oh, H., et al. Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction. Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).
- Martin, C. M., et al. Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart. Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).
- Pfister, O., et al. CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation. Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).
- Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).
- Laugwitz, K. L., et al. Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages. Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).
- Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).
- Matsuura, K., et al. Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes. Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).
- Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model. International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).
- Vicinanza, C., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification. Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).
- Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others. American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).
- Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli. Blood. 90 (1), 148-155 (1997).
- Ogawa, M., et al. Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells. Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).
- Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function. Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Pfister, O., et al. Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells. Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).
- Davis, D. R., et al. Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue. PLoS One. 4 (9), e7195 (2009).
- Carr, C. A., et al. Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study. PLoS One. 6 (10), e25669 (2011).
- Martens, A., et al. Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration. Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).
- Cheng, K., et al. Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction. Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260 (2014).
- Mochizuki, M., et al. Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells. Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).
- Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining. Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Plaisance, I., et al. Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression. JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).
