Dit protocol beschrijft een endothelial differentiatie techniek voor cardiale voorlopercellen. Het richt zich vooral op de invloed van serumconcentratie en cel-zaaien dichtheid op de endotheliale differentiatie mogelijkheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Inductie van Endothelial differentiatie in cardiale voorlopercellen onder lage Serum voorwaarden
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cardiale voorlopercellen (CPC) wellicht therapeutisch potentieel voor cardiale herstel na blessure. In de volwassen zoogdieren hart, intrinsieke CPCs zijn uiterst schaars, maar uitgebreide CPCs zou nuttig voor celtherapie. Een voorwaarde voor het gebruik ervan is hun vermogen om te onderscheiden op een gecontroleerde manier in de diverse cardiale geslachten gedefinieerd en efficiënte protocollen gebruiken. Bovendien, bij in vitro expansie, CPC's die bij patiënten geïsoleerd zijn of preklinische ziekte modellen vruchtbare onderzoeksmiddelen voor het onderzoek naar de ziekte mechanismen kunnen bieden.
Huidige studies gebruiken verschillende markeringen ter identificatie van CPC. Echter zijn niet alle van hen uitgedrukt in mens, die beperkt de translationeel impact van sommige Preklinische studies. Differentiatie-protocollen die zijn van toepassing ongeacht de isolatie-techniek en marker-expressie zal voor de gestandaardiseerde uitbreiding en priming van CPC's voor cel therapie doel toestaan. Hier beschrijven we dat de priming van CPC's onder een lage foetale runderserum (FBS) concentratie laag cel dichtheid vergemakkelijkt de endothelial differentiatie van het CPCs. met behulp van twee verschillende subpopulaties van muis en rat CPCs, we laten zien dat laminin is een meer geschikt substraat dan fibronectine daartoe krachtens het volgende protocol: na het kweken voor 2-3 dagen in medium met inbegrip van de supplementen die multipotent handhaven en met 3,5% FBS, CPCs worden overgeënt op laminin op < 60% samenvloeiing en gekweekte in supplement-gratis medium met lage concentraties van FBS (0,1%) voor 20-24 uur voor differentiatie in endotheel differentiatie medium. Omdat het CPCs zijn een heterogene populatie, wellicht serum concentraties en incubatie tijden worden aangepast afhankelijk van de eigenschappen van de respectieve CPC subpopulatie. Gezien dit, de techniek kan worden toegepast op andere soorten CPCs ook en biedt een handige methode om te onderzoeken van het potentieel en de mechanismen van differentiatie en hoe ze worden beïnvloed door ziekte bij het gebruik van CPC's geïsoleerd van de respectieve ziekte modellen.
Inleiding
Recente studies ondersteunen het bestaan van resident cardiale voorlopercellen (CPC) in de2,van volwassen zoogdieren hart1,3, en CPC's zou een nuttige bron voor celtherapie na cardiale letsel4, 5. Bovendien uitgebreide CPCs kunnen voorzien in een vruchtbare model drug screening en het onderzoek naar de ziekte mechanismen als geïsoleerde patiënten met zeldzame aandoeningen, of aan respectieve ziekte modellen6,7.
CPC's geïsoleerd van ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het gebruik van muizen voor cel isolatie doel was volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren en met de Zwitserse wet op dier en werd goedgekeurd door de Zwitserse kantonnale autoriteiten.
Opmerking: De isolatie van Sca-1+/CD31- SP-CPC's vanuit het hart van de muis was in wezen gedaan als eerder beschreven34 met enkele wijzigingen. Zie Tabel van materialenvoor de materialen en de gebruikte reagentia. Voor alle experimenten, werden cardiale SP-CPC's geïsoleerd van muizen versterkt gepasseerd en gebruikt in een cel lijn-achtige manier. Passages 7-20 werden ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Muis SP-CPC-isolatie:
In deze studie gebruikten we muis CPCs geïsoleerd volgens de SP fenotype, overwegende dat de resultaten van rat CPCs zijn gewijzigd en toegevoegd van een vorig rapport met toestemming (Figuur 8)33.
Celproliferatie onder hoge en lage cel dichtheden en met verschillende Serum concentraties:
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voordelen van dit Protocol:
Dit protocol biedt een endothelial differentiatie techniek van het CPCs. We vonden dat een lage serumconcentratie en lage celdichtheid de efficiëntie van endothelial differentiatie, waarbij LN bleek te zijn een meer geschikte substraat dan FN onder deze omstandigheden zou kunnen verbeteren. We gebruikten twee verschillende soorten CPCs: rat CPCs, die werden gebruikt in een cel lijn-achtige wijze, en muis SP-CPC's, die werden geïsoleerd en uitgebreid. Met name het proto.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Vera Lorenz voor haar nuttige ondersteuning tijdens de experimenten en het personeel van de Stroom Cytometry faciliteit van het departement van biogeneeskunde (DBM), de Universiteit en de Universiteit ziekenhuis Bazel. Dit werk werd gesteund door het verblijf-on track program van de Universiteit van Bazel (tot Michika Mochizuki). Gabriela M. Kuster wordt ondersteund door een subsidie van de Zwitserse National Science Foundation (subsidie nummer 310030_156953).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Kweekmedium | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ThermoFisher | #12440 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Nutrient Mixture F12 Ham | Merck | #D8437 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | 3.5% (0.1% voor lijnage-inductie) |
| L-Glutamine | ThermoFisher | #25030 | Eindconcentratie 2 mM |
| Glutathione | Merck | #G6013 | |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | #AF-100-15 | |
| Recombinant Basic Fibroblast Growth Factor (FGF) | Peprotech | #AF-100-18B | |
| B27 Supplement | ThermoFisher | #17504044 | |
| Cardiotrophin 1 | Peprotech | #250-25 | |
| Thrombin | Diagontech AG, Zwitserland | #100-125 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #14170 | |
| 0.05 % Trypsin-EDTA | ThermoFisher | #25300 | |
| T75 Flask | Sarstedt | #83.3911 | |
| Endotheeldifferentiatie | |||
| Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit | Lonza | #CC-3162 | |
| Ham's F-12K (Kaighn's) Medium | ThermoFisher | #21127 | |
| Laminin | Merck | #L2020 | |
| Fibronectin | Merck | #F4759 | Verdunnen in ddH2O |
| 6 Well Plate | Falcon | #353046 | |
| Formaldehyde Solution | Merck | #F1635 | Verdunnen 1:10 in PBS (3.7% eindconcentratie) |
| Triton X-100 | Merck | #93420 | 0.1% in ddH2O |
| Normal Goat Serum (10%) | ThermoFisher | #50062Z | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | #ab6994 | 1:100 in 10% geitenserum |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher | #A11010 | 1:500 in 10% geitenserum |
| 4',6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride (DAPI) | ThermoFisher | #62247 | 1:500 in ddH2O |
| SlowFade Antifade Kit | ThermoFisher | #S2828 | |
| BX63 widefield microscope | Olympus | ||
| Buisvorming | |||
| 96 Well Plate | Falcon | #353072 | |
| 5 ml ronde bodembuis met zeefdop | Falcon | #352235 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | #354230 | |
| IX50 widefield microscope | Olympus | ||
| Sca-1+/CD31- cardiac side population isolatie34 | |||
| Reagentia | |||
| Pentobarbital Natrium 50 mg/ml voor veterinair gebruik | eigen ziekenhuisapotheek | #9077862 | Werkoplossing: 200 mg/kg |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-) | ThermoFisher | #20012 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), fenolrood (-) | ThermoFisher | #14175 | Bereid HBSS 500 mL + 2% FBS voor het dempen van Collagenase B-activiteit |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1g/L van D-Glucose, L-Glutamine, Pyruvaat | ThermoFisher | #331885 | Bereid DMEM + 10% FBS + 25 mM HEPES+ P/S voor Hoechst-kleuring |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | #15140122 | |
| HEPES 1 M | ThermoFisher | #15630080 | Eindconcentratie 25 mM |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | #SH30071 | |
| RBC LysisBuffer (10X) | BioLegend | #420301/100mL | Verdunnen tot 1X in ddH2O en filteren door een 0.2 µm filter |
| Collagenase B | Merck | #11088807001 | Eindconcentratie 1 mg/mL in HBSS, gefilterd door een 0.2 µm filter |
| bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst) | Merck | #B2261 | Bereid 1 mg/mL in ddH2O |
| Verapamil-hydrochloride | Merck | #V4629 | Eindconcentratie 83.3 µM |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | #551262 | 0.25 µg/107cellen |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BD Biosciences | #557405 | 0.6 µg/107cellen |
| 7-Aminoactinomycine D (7-ADD) | ThermoFisher | #A1310 | 0.15 µg/106cellen |
| APC rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #553932 | 0.25 µg/107cellen |
| FITC Rat IgG2a k Isotype Control | BD Biosciences | #554688 | 0.6 µg/107 |
Referenties
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114 (6), 763-776 (2003).
- Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
