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Cancer Research

表面增强共振拉曼散射纳米探针比比法检测微卵巢癌的意义上

Published: March 25, 2019
doi:
10.3791/58389
, , , , ,
1Department of Radiology,Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry,The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program,Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT),Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology,Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

Summary

卵巢癌在腹腔内形成转移。在这里, 我们提出了一个协议, 以制作和使用叶酸受体靶向表面增强共振拉曼散射纳米探针, 揭示这些病变具有高度的特异性,通过比例成像。纳米探针在腹腔内对活着的小鼠进行处理, 所得图像与组织学有很好的相关性。

Abstract

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤。大多数患者处于晚期 (FIO iii 或 IV 期), 当局部转移扩散已经发生。然而, 卵巢癌有一个独特的转移扩散模式, 因为肿瘤植入物最初包含在腹腔内。这一特点原则上可以使肿瘤植入物的完全切除具有治疗意图。这些转移性病变中的许多都是微观的, 很难识别和治疗。中和这种微转移被认为是消除肿瘤复发和实现长期生存的主要目标。具有表面增强共振的拉曼成像拉曼散射纳米探针由于其明亮和生物正交特征, 可用于高灵敏度的显微肿瘤的描述。在这里, 我们描述了这种纳米探针的两种 “味道” 的合成: 一种是针对叶酸受体的抗体功能化的合成–在许多卵巢癌中过度表达–另一种是非靶向对照纳米探针, 具有明显的光谱。纳米探针在腹腔内联合给转移性人卵巢腺癌的小鼠模型。所有动物研究都得到了纪念斯隆·凯特林癌症中心动物护理和使用委员会的批准。用拉曼显微光谱仪对动物的腹腔进行手术暴露、清洗和扫描。随后, 使用经典最小二乘拟合算法对这两个纳米探针的拉曼特征进行解耦, 并对它们各自的分数进行划分, 以提供叶酸比非目标探针更有针对性的比率信号。通过这种方式, 显微镜转移是可视化的高特异性。这种方法的主要优点是, 局部应用到腹腔-这可以在手术过程中方便地做-标签肿瘤, 而不会使患者受到系统的纳米颗粒暴露。通过采用比率法, 将具有不同拉曼特征的靶向和非靶向纳米探针作为混合物应用, 可以消除纳米探针与内脏表面的非特定结合所产生的假阳性信号。由于缺乏商业广域拉曼成像摄像系统, 这一程序目前仍然受到限制, 一旦可用, 就可以在手术室应用这一技术。

Introduction

具有 “表面增强拉曼散射” (sers) 纳米粒子的拉曼成像在描述各种环境中的病变以及许多不同类型的肿瘤 1、2、3、4方面显示出巨大的希望.SERS 纳米粒子的主要优点是它们的指纹样光谱特征, 使它们能够毫无疑问地检测到生物背景信号5。此外, 发射信号的强度进一步放大, 使用记者分子 (染料) 与激发激光器一致的吸收极大值, 产生 “表面增强共振拉曼散射” (serrs)具有更高灵敏度的纳米粒子6、7、8、9、10、11、12.

采用 se (r) rs 纳米颗粒13和许多其他纳米颗粒结构 14, 15 临床使用需要解决的一个障碍是它们的给药方式, 因为静脉注射导致系统性剂的暴露, 并需要广泛的测试, 以排除潜在的不利影响。在本文中, 我们提出了一个不同的范式, 基于在体内局部应用纳米粒子, 直接进入腹腔在手术过程中, 然后是一个洗涤步骤, 以消除任何未绑定的纳米粒子1。这种方法符合目前正在研究的新的治疗方法, 这些方法也利用局部注射剂进入腹腔, 称为高温腹腔内化疗 (HIPEC)。因此, 该原则本身应该相对容易融入临床工作流程。我们研究了腹腔内应用后纳米颗粒的生物分布, 但没有观察到任何可检测到的吸收到全身循环1。此外, 局部应用方法规避网状内皮系统对纳米颗粒的固存, 从而显著减少了所需的纳米颗粒的数量。然而, 当局部应用时, 抗体功能化纳米粒子倾向于粘附在内脏表面上, 即使在没有目标的情况下也是如此。为了最大限度地减少由于非特异性纳米粒子粘附而产生的假阳性信号, 我们采用了一种比率测量方法, 即分子靶向纳米探针提供特定信号, 以及具有不同拉曼光谱的非靶向对照纳米探针,帐户的非特定背景16,17。我们最近在弥漫性卵巢癌1的小鼠模型中展示了局部应用表面增强共振拉曼比率光谱法。

该方法的总体目标是开发两个 SERRS 纳米探针, 一个有针对性的, 一个是非特异的, 在小鼠模型中局部应用, 以便利用两个探针的比率测量来成像与癌症相关的生物标志物的显性过度表达通过拉曼成像。在这项工作中, 叶酸受体 (fr) 被选择为目标, 因为这是一个标记在许多卵巢癌18,19。拉曼微光成像与 sers 为基础的纳米粒子也被证明用于癌细胞的鉴定20。合成了拉曼纳米粒子的两种不同的 “味道”, 每种化合物都是从不同的有机染料中提取指纹的。纳米粒子由一个星形金芯组成, 周围是一个硅壳, 并在大约710纳米处显示表面等离子体共振。拉曼机 (有机染料) 与硅壳的形成同时沉积。最后, 对于 frs 靶向纳米探针 (Α-Fr-nps), 二氧化硅壳与抗体结合, 而非靶向纳米探针 (nt-NPs) 则与聚乙二醇单层钝化。

该技术成功地用于绘制弥漫性转移性卵巢癌 (SKOV-3) 小鼠异种移植模型中的显微肿瘤图, 证明了其在体内使用的适用性。它还可以扩展用于切除组织, 肿瘤表型, 或脱粒后边缘的确定, 如同源研究21所示。

SERS 纳米探针为创建多个生物标志物的目标标签提供了一个强大的平台, 如图 1所示, 通过简单的化学反应合成。在这里, 我们提出了合成两种类型的 SERRS 纳米探针 (第1-3 节) 的协议, 开发一个合适的卵巢癌小鼠模型 (第4节), 纳米探针的管理和成像 (第5节), 最后的数据分析和可视化 (第6节)。

Protocol

所有动物研究都得到了纪念斯隆·凯特林癌症中心 (#06-07-011) 机构动物护理和使用委员会的批准。 1. 金纳米星芯合成 请注意:在本实验中, 金纳米星被用作两种类型的 SERS 纳米探针的核心。 在去离子水中制备 800 mM 抗坏血酸 (c6h8o6) 溶液, 在 di 水中制备 20 mm 四氯油酸 (hauccl4) 溶液 8 ml.冷却至4°C。 ?…

Representative Results

为了质量控制的目的, 纳米粒子可以在合成过程中使用各种方法进行表征, 包括 TEM、DLS、纳米粒子跟踪分析和 UV/Vis 吸收光谱, 如图 2所示。 通过这种方式, 可以验证金纳米岩核的大小 (第1节所述)、硅壳的形成 (第2节) 和随后的表面功能化 (第3节) (图 2)。通常情况下, 金纳米核的大小 (…

Discussion

本文所述的协议为 SERRS 纳米探针两种 “味道” 的合成及其在小鼠体内的应用提供了指导, 用于应用于卵巢肿瘤过度表达叶酸受体的拉曼成像, 并采用了比率法。与其他光学成像技术 (如荧光) 相比, 拉曼成像的主要优势在于纳米探针信号的高特异性, 而纳米探针信号不能与任何生物来源的信号混淆。在拉曼成像的这一实施例中, 纳米颗粒不是静脉注射的, 而是局部的, 通过腹腔内注射, 然后是一个单一的…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

确认了以下资金来源 (对 m. f. k.): NIH R01 EB017748、R01 CA222836 和 K08 CA16396;达蒙 Runyon-Rachleff 创新奖 DRR-29-14, 潘兴广场索恩奖, 由潘兴广场索恩癌症研究联盟, MSCCC 分子成像 & 纳米技术中心 (CMINT) 和技术开发赠款。还向 MSCC NIH 核心赠款 (P30-ca008748) 提供的赠款资助支助提供了确认服务。

Materials

Name of Reagent
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A5960
3-MPTMS Sigma-Aldrich 175617
Ammonium hydroxide (28%) Sigma-Aldrich 338818
Anti-Folate Receptor antibody [LK26]  AbCam ab3361
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich 276855
Dimethyl sulfoxide (anhydrous) Sigma-Aldrich 276855
Ethanol Sigma-Aldrich 792780
IR140 Sigma-Aldrich 260932
IR780 perchlorate* Sigma-Aldrich 576409 Discontinued*
Isopropanol Sigma-Aldrich 650447
N.N.Dimethylformamide Sigma-Aldrich 227056
PEG crosslinker Sigma-Aldrich 757853
PEG-maleimide Sigma-Aldrich 900339
Tetrachloroauric Acid Sigma-Aldrich 244597
Tetraethyl Orthosilicate Sigma-Aldrich 86578
*IR792 Sigma-Aldrich 425982 *Alternative
Name of Equipment
Dialysis cassette (3,500 MWCO) ThermoFIsher 87724
Centrifugal filters Millipore UFC510096
inVia confocal Raman microscope Renishaw
MATLAB (v2014b) Mathworks
PLS Toolbox (v8.0) Eigenvector research
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References

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Andreou, C., Oseledchyk, A., Nicolson, F., Berisha, N., Pal, S., Kircher, M. F. Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting. J. Vis. Exp. (145), e58389, doi:10.3791/58389 (2019).
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