Dette dokumentet beskriver en ny modell av primære blast traumatisk hjerneskade. En komprimert luft drevet sjokk rør brukes til å utsette i vitro musen hippocampus skive kulturer til et enkelt sjokk bølge. Dette er en enkel og rask protokoll genererer en reproduserbar hjerneskade vev med en høy gjennomstrømning.
Traumatisk hjerneskade er en ledende årsak til død og uførhet i militære og sivile befolkninger. Blast traumatisk brain skader resultater fra detonasjon av sprenglegemer, men mekanismer som ligger til grunn hjernen skader som følge av eksplosjonen overtrykk eksponering er ikke helt forstått og antas å være unike for denne typen hjerneskade. Prekliniske modeller er avgjørende verktøy som bidrar til å bedre forstå blast-indusert hjerneskade. En roman i vitro blast TBI-modellen ble utviklet ved hjelp av en åpent sjokk tube for å simulere virkelige åpen-feltet blast bølger modellert av Friedlander bølgeform. C57BL/6N musen organotypic hippocampus skive kulturer ble utsatt for enkelt sjokkbølger og utviklingen av skaden var preget til 72 h bruker propidium iodide, en veletablert fluorescerende markør for celleskader som bare trenger celler med kompromittert mobilnettet membraner. Propidium iodide fluorescens var betydelig høyere i skiver utsatt til en eksplosjon sammenlignet med humbug skiver gjennom hele protokollen. Vev hjerneskade er veldig reproduserbare og proporsjonal med topp overtrykk av sjokkbølgen brukes.
Blast traumatisk hjerneskade (TBI) er en kompleks type hjerneskade som detonasjon av sprenglegemer1,2. Blast TBI har framstått som et stort helseproblem i de siste 15 årene med nyere militære konfliktene i Irak og Afghanistan2,3. Samlet sett er det anslått at mellom 4,4% og 22,8% av soldater tilbake fra Irak og Afghanistan har lidd mild TBI, en stor andel av disse var blast-relatert, med en høyere rapporterte rate av blast TBI i de amerikanske styrkene sammenlignet med de britiske styrkene4 ,5.
Bruk av improviserte eksplosive enheter har vært ansvarlig for blast-assosiert trauma, inkludert blast TBI, holdt ut av den militære styrker6. Detonasjon av en eksplosiv belastning resulterer i en svært rask, men forbigående-økt press, forekommer i millisekunder. Den resulterende overtrykk bølgen fra en virkelige gratis-feltet eksplosjon er modellert av funksjonen Friedlander, med en plutselig oppstigning til toppen overtrykk etterfulgt av en eksponensiell decay7,8. Ekstreme styrker og deres rask tid kurs i en blast hendelsen er vanligvis ikke oppleves i ikke-blast traumer1,9. Topp overtrykk, som er maksimalt trykk av bølgeform, og varigheten av den positive bølgen antas å være viktige bidragsytere til blast hjerneskade og dette er avhengig av eksplosiv ladning og avstand fra detonasjon10, 11.
Traumer at resultater fra en eksplosiv eksplosjon er klassifisert som fire atskilte komponenter, angitt som primær, sekundær, tertiær og kvartær blast, skade,10,,12,,13,,14. Hver av disse komponentene er forbundet med spesifikke mekanismene for skade. Primære blast skade resultater fra direkte aksjon av overtrykk bølgen på organer og vev2,13. Sekundær blast skade resultater fra virkningen av prosjektil, forårsaker gjennomtrengende og ikke-gjennomtrengende sår2,15. Tertiær eksplosjon skader oppstår når offerets kropp er fordrevet mot bakken eller rundt objekter og er forbundet med akselerasjon/retardasjon styrker1,10,13. Kvartær eksplosjon skader beskriver en heterogen gruppe skader direkte relatert til eksplosjonen ikke dekkes av de første tre skade mekanismer beskrevet12,13. Det inkluderer (men er ikke begrenset til) termisk skade, røyk innånding, stråling, elektromagnetiske bølger og psykiske bivirkninger13,15. De fleste blast-assosiert TBI resultater direkte fra de første tre mekanismene for skade, mens kvartær mekanismer for eksplosjon skader er vanligvis forbundet med systemisk skade13. Effekten av akselerasjon/retardasjon (f.eks, whiplash) sløv og gjennomtrengende traumatisk hjerneskade har vært grundig studert i forhold til andre typer TBI (f.eks, motorkjøretøyer krasjer, faller, ballistisk skade). Men den primære blast overtrykk bølgen er unik for eksplosjon skader og dens virkning på hjernevev er mye mindre godt forstått16. Primære eksplosjon skader mekanismer knyttet en overtrykk bølge, er først av de mekaniske kreftene samhandle med hjernen.
Mange prekliniske TBI modeller har blitt utviklet over de siste tiårene som har vært uvurderlig for å forstå blast TBI mekanismer for skade og patofysiologi og undersøke potensielle nye behandlinger, som ellers ville være umulig å gjøre utelukkende Angi17,18,19i klinisk. Selv om ingen enkelt prekliniske modell kan reprodusere kompleksiteten i klinisk blast hjernen traumer, vanligvis replikere ulike prekliniske TBI modeller forskjellige aspekter av menneskelig TBI. Ødeleggende virkningen av krefter knyttet en blast eksplosjon kan studeres isolert eller i kombinasjon i både i vitro og vivo blast TBI modeller. In vitro modeller har fordelen at en stram kontroll over eksperimentell miljøet (vev fysiologiske forhold og skade biomekanikk), som reduserer biologisk variasjon og forbedrer reproduserbarhet, tillater studiet av spesifikke molekylær kaskader uten forstyrrende faktorer i dyr modeller20. Målet var å utvikle en i vitro modell for å undersøke effekten av primære blast på hjernevev. Vi som mål å utvikle en modell med en overlyds shockwave med en Friedlander bølgeform representant for en gratis-feltet eksplosjon som produsert av en improvisert eksplosiv innretning (IED).
Blant alle mekanismer for skader forbundet med blast TBI (Primær, sekundær og tertiær eksplosjon skader mekanismer), primære eksplosjon skader er unik for blast traumer og det er den minst forståtte av blast-assosiert mekanismer1,2 . Romanen protokollen beskrevet her ble utviklet for å studere primære blast TBI bruker en åpent sjokk tube for å avsløre i vitro musen hippocampus skive kulturer til et enkelt sjokk bølge med en enkel og rask protokoll som tillater etablering av en reproduserbar primære blast TBI med en høy gjennomstrømning.
Første i vitro primære blast TBI modeller brukt hydrostatisk trykkbølger celler26,27. Men modell press utdataene ikke funksjonen Friedlander som varigheten av en hydrostatisk trykk puls var mye lengre enn luftbårne blast overtrykk bølger13. Karakteristiske Friedlander funksjonen kan lett modellert i laboratoriet ved hjelp sjokk tube1,8. Sjokk røret kan produsere sjokkbølger som simulerer virkelige åpne feltet eksplosjoner i en konvensjonell laboratoriemiljø, stund tillater presis kontroll av bølge parametere, for eksempel peak overtrykk, positive bølgen varighet og impuls, ved å variere de membran materiale og tykkelse, og driver volume8,28,29.
Enkel i vitro modeller som cellekulturer vanligvis ikke heterogenitet celletyper og synaptic tilkobling30. Effekten av blast på i vitro hjernecelle ‘spheroids’ omfatter ulike celletyper har nylig vært undersøkt31. Videre undersøkelser av disse interessante forberedelser er fortjent; men er det ikke klart hvordan mobilnettet organisasjonen og tilkobling gjenspeiler intakt hjernen. OHSC er en godt etablert i vitro eksperimentell modell23,32, er enkle å kultur og deres tredimensjonale vev cytoarchitecture, celledifferensiering og synaptic tilkobling er godt bevart og veldig ligner på den i vivo33,34,35,36. OHSCs representerer et middels nivå av kompleksitet mellom cellekultur og en i vivo model23,32. OHSCs har vist seg å reprodusere i vitro patologisk nevrodegenerative cascades sett i vivo modeller og har vært veldig nyttig i screening av potensielle neuroprotective narkotika og forstå deres mekanismer av handlingen17,21,22,37,38. Til slutt anatomiske området studert, hippocampus, er svært relevant i translational studier for TBI, denne regionen er ofte skadet i TBI pasienter39,40,41. OHSC har blitt brukt til modell eksplosjon TBI28,42,43,44, men vår modell er relativt enkel og kan være tilpasset eksisterende sjokk-rør i enten vannrett eller loddrett konfigurasjoner uten kompliserte tilpasninger.
OHSC kan holdes i kulturen i mange dager, som muliggjør etterforskningen av biologiske prosesser over tid34. I denne modellen, vev skade som skyldes sjokkbølgen eksponering ble målt daglig over tre dager, etter eksplosjon eksponering bruker propidium iodide, en veletablert markør for celleskader. Propidium iodide er en talt ikke toksisk svært polar fargestoff som trenger cellene med kompromittert mobilnettet membraner, hvor det binder seg til nucleic syrer og utstillinger en karakteristisk lyse røde fluorescens24,25,45. Fluorescens målt med propidium iodide har vist å ha en god sammenheng med skadet celletall bruker Nissl flekker46,47.
Gitt at skaden produsert i denne modellen var diffus (figur 2C), ble fluorescens av hele stykket målt når du utfører analysen, ligner på tidligere publisert arbeid i andre hjernen skade paradigmer21,22 , i stedet for å bruke bestemte regioner, som har vært gjort i andre i vitro blast TBI modeller28,43,44,48. Global tilnærming brukes i modellen beskrevet i denne artikkelen eliminerer potensielle variasjon som er innført når skisserte definerte områder av interesse og gir en mer helhetlig bilde av blast-relaterte skader. Både sjokkbølge peak overpressures, 50 kPa og 55 kPa, produsert signifikant (p < 0,05 og p < 0,0001, henholdsvis) skade sammenlignet med humbug skiver (figur 2B). Som forventet, sjokkbølgen med høyeste topp overtrykk, produsert 55 kPa, mer skade enn 50 kPa bølgen. I en i vitro modell med isolert hjernen utsatt vev direkte for en shockwave, hvor nøyaktig skalere hele organismen eller et menneske er ikke enkel. Likevel er trykkbølger vi innenfor området for topp overpressures observert i felt, vanligvis 50-1000 kPa8,49.
For å opprettholde OHSC utsatt for fysiologiske temperatur og nivåer av oksygen og karbondioksid, samtidig var fri fra forurensning gjennom sjokkbølgen eksponering protokollen, ble vev kultur skivene forseglet i sterilt polyetylen poser etter en steril teknikk, neddykket i eksperimentell medium varmet til 37 ° C og ferske frikirkelige 95% oksygen og 5% karbondioksid, på samme måte som tidligere utgitte verk28,43,44 ,48. I motsetning til disse modellene der komplekse enheter ble brukt til å holde de sterile posene under sjokkbølgen eksponering, i denne protokollen, ble en enkel og rask metode brukt til å suspendere OHSC vev kultur skivene foran sjokk tube uttaket (figur 1A, C ). Modellen beskrevet i denne hvitboken tillater rask behandling og høy gjennomstrømning, samtidig som risikoen for nedkjøling. Disse aspektene er spesielt relevant for neuroprotection studier at noen terapeutisk intervensjon kan ha en svært begrenset tidsvindu av potensielle programmet etter TBI. Denne romanen sjokkbølgen eksponering protokollen lar 6 til 9 vev kultur setter inn (vanligvis 36 til 54 hippocampus organotypic vev skiver) for å bli utsatt for et sjokk bølge i et kort tidsrom (ca 1 h).
OHSCs krever god steril teknikk hele. Det er viktig å bruke en steril laminær strømning hette dyrking og ved overføring til sterile poser for blast. For å gjennomføre skive avbilding under aseptiske forhold med lokkene av 6-vel platene på plass, bruker vi skreddersydde metall ringer for å heve celle kultur skivene til fokalplanet av mikroskopet. En viktig del av vår protokollen er at vi inkluderer uskadet humbug skiver i hvert eksperiment. Humbug skiver blir behandlet identisk til blast skiver med unntak at ikke aktiveres sjokk-røret; et annet viktig skritt er at alle sektorer er fotografert 1t før skade eller humbug behandling, slik at helsen til befolkningen i skiver brukes er identisk (figur 2B).
I tillegg til kvantifisere celle skade i skiver over tid, kan vevet være fast ved slutten av forsøket for konvensjonelle immunohistochemistry50. Vi og evaluering metoden bruker musen hippocampus skiver. Imidlertid kan våre teknikk være enkelt tilpasses til å bruke andre vev som kan dyrkes i kultur, som ryggmargen, netthinnen, lunge eller epitel vev. I dette papiret og våre tidligere arbeid med modellen undersøkte vi bare effekten av eksponering for et eneste skudd. Men ville modellen være godt egnet til å undersøke effekten av gjentatt lavnivå støt på hjernen eller andre vev. OHSCs kan holdes i kultur for mange uker eller måneder, slik at kroniske virkninger undersøkes.
In vitro modeller, blir enklere enn i vivo modeller, har en høyere frekvens, er billigere og eksperimenter kan vanligvis gjennomføres i en kortere tid skala17. Men resultatene bruker i vitro modeller må valideres i dyremodeller i vitro kultivert vev er holdt i kunstig miljø og svarer til skade annerledes fra hva de ville i vivo17. Likevel, i vitro modeller har vært svært verdifulle i økt vår forståelse av hjernen skade cascades og i screening neuroprotective stoffer før bruk av mer komplekse i vivo modeller17,22 , 51 , 52. til tross for de mange fordelene som tilbys av denne modellen, er det viktig å merke seg at i vitro modeller mangler nøkkelen vise egenskaper av TBI stede i dyr og i vivo modeller, for eksempel effekter på karsystemet, økt intrakranielt Trykk, systemisk immunrespons og funksjonelle atferdsmessige svekkelse, som fremhever behovet for å validere resultatene i i vitro modeller i hele dyret. I vitro modeller som modellen beskrevet i denne hvitboken er imidlertid svært nyttig translationally relevante vitenskapelige verktøy.
Avslutningsvis beskriver dette verket en enkel og grei romanen metode der mus organotypic hippocampus vev kulturer er utsatt for tett kontrollert og reproduserbar virkelige relevante sjokkbølger bruker et laboratorium sjokk rør. Den globale skaden, som ble kvantifisert bruker propidium iodide, merketråd veletablerte celle skade, er svært reproduserbar og er proporsjonal med topp overtrykk av sjokkbølger brukes.
The authors have nothing to disclose.
Støttet av: Royal senter for forsvar medisin, Birmingham, Storbritannia, Royal britiske Legion senter for Blast skade studier, Imperial College London, Storbritannia. Medisinsk Forskningsråd, London, Storbritannia (MC_PC_13064; MR/N027736/1). Gass sikkerheten stoler, London, Storbritannia. Rita Campos-Pires var en doktorgrad trening-pris fra Fundação para en Ciência e en Tecnologia, Lisboa, Portugal. Katie Harris var mottakeren av en PhD studentship fra den Westminster medisinsk skolen Research Trust, London, Storbritannia.
Denne modellen ble utviklet med støtte fra den kongelige britiske Legion sentrum for Blast skade studier (RBLCBIS) ved Imperial College. Vi ønsker å erkjenne økonomisk støtte av den kongelige britiske Legion. Forskere interessert i samarbeid eller nærmere kan kontakte forfatterne eller RBLCBIS.
Vi takker Dr. Amarjit Samra, direktør for forskning, treningssenter for forsvar medisin, Birmingham, Storbritannia, for å støtte dette arbeidet, Scott Armstrong, avdeling av kirurgi og kreft, Imperial College London, for å få hjelp med foreløpig eksperimenter , Theofano Eftaxiopolou, Hari Arora & Luz Ngoc Nguyen, Institutt for bioteknologi Imperial College London, og William Proud, avdeling for fysikk Imperial College London for råd om sjokk-røret, Raquel Yustos, forskning tekniker, avdeling Biovitenskap, Imperial College London for teknisk støtte, Paul Brown MBE, utdanningsansvarlig og Steve Nelson, workshop tekniker, ringer Institutt for fysikk, Imperial College London, for å gjøre metall, Neal Powell av Institutt for fysikk, Imperial College London for kunstverk.
Geys balanced salt solution | Sigma UK | G9779 | |
D- glucose | Sigma UK | G8270 | |
Antibiotic/antimycotic | Sigma UK | A5955 | |
Minimum essential medium Eagle | Sigma UK | M4655 | |
Hanks balanced salt solution | Sigma UK | H9269 | |
Horse serum | Sigma UK | H1138 | |
L-glutamine | Sigma UK | G7513 | |
HEPES | VWR Prolabo, Belgium | 441476L | |
Sodium hydroxide | Sigma UK | S-0945 | |
Tissue culture inserts | Millicell CM 30 mm low height Millipore | PICM ORG 50 | |
6-well plates | NUNC, Denmark | 140675 | |
Propidium iodide | Sigma UK | P4864 | |
Sterile polyethylene bags – Twirl'em sterile sample bags | Fisherbrand | 01-002-30 | |
Portex Avon Kwill Filling Tube 5" (127mm) | Smiths Medical Supplies | E910 | |
Epifluorescence microscope | NIKON Eclipse 80i, UK | ||
Microscope objective | Nikon Plan UW magn. 2x, NA 0.06, WC 7.5 mm | ||
Microscope filter | Nikon G-2B (longpass emission) | ||
Mylar electrical insulating film, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm | RS Components UK | 785-0782 | |
Pressure transducer | Dytran Instruments Inc. | 2300V1 | |
Tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Co., Guildford, Surrey, United Kingdom. | Mcllwain tissue chopper | |
Silicone elastomer | Dow Corning, USA | Sylgard 184 | |
Graphing & statistics software | GraphPad Software, USA | Prism 7.0 |