Realtid kvantitativa polymerase chain reaktion analys i kombination med omvänd Transkription (RT-qPCR) har använts att mäta nivån av RNA-virusinfektioner. Här presenterar vi en direkt RT-qPCR-analys, som inte kräver ett RNA reningssteg, utvecklat för kvantifiering av flera RNA virus, inklusive denguefeber virus.
För närvarande realtid polymeras-kedjereaktion (PCR) teknik är ett oumbärligt verktyg för identifiering och kvantifiering av virala genomer i forskningslaboratorier samt för molekylär diagnos, på grund av dess känslighet, specificitet, och bekvämlighet. Dock i de flesta fall, kvantitativ PCR (qPCR) analysen allmänt används för att upptäcka virusinfektion har förlitat sig på rening av viral nukleinsyra före steget PCR. I denna studie utvecklas fluorescens-baserade omvänd Transkription (RT-qPCR) qPCR analysen genom en kombination av en bearbetning buffert och en one-step RT-PCR reagens så att hela processen, från skörden av kultur supernatanten av virusinfekterade cellerna fram till realtid detektering, kan utföras utan viral RNA rening. Etablerade protokollet möjliggör kvantifiering av ett brett utbud av RNA koncentrationer av denguefeber virus (DENV) inom 90 min. Dessutom demonstreras anpassningsförmåga hos direkt RT-qPCR-analys till utvärderingen av ett antiviralt medel av ett in vitro- experiment med en tidigare rapporterade DENV hämmare, mykofenolsyra (MPA). Dessutom kan andra RNA-virus, inklusive gula febern-virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV) och mässlingvirus (MeV), kvantifieras genom direkta RT-qPCR med samma protokoll. Den direkt RT-qPCR-analys som beskrivs i denna rapport är därför användbar för övervakning av RNA-virus replikeringen på ett enkelt och snabbt sätt, vilket kommer att vidareutvecklas till en lovande plattform för en high-throughput screening-undersökningen och klinisk diagnos.
Släktet Flavivirus av flavivirus -familjen omfattar mer än 70 höljeförsedda, positiv-stranded RNA-virus som överförs av myggor och fästingar. Ännu viktigare, leder flavivirus infektion hos människor ofta till svår klinisk sjukdom, såsom hemorragisk feber och encefalit1. Faktiskt, ett senaste utbrott av zikaviruset (ZIKV), ett flavivirus, spridit sig explosionsartat i hela Amerika och har visat sig vara associerade med neurologiska komplikationer, inklusive mikrocefali2,3. Flavivirus, har därför betydande kliniska och ekonomiska inverkan på det moderna samhället.
En viktig flavivirus är denguefeber virus (DENV), en moskitburen virus spridda i de tropiska och subtropiska områdena i världen. DENV överförs av Aedes myggor, inklusive Aedes albopictus och Aedes aegypti, vilket resulterar i den globala spridningen av denguefeber utbrott4. För närvarande, den Världshälsoorganisationen (WHO) klassificerar denguefeber sjukdom som tre kategorier: dengue utan varningssignaler, denguefeber med varningsskyltar och svår denguefeber4. Även om primära infektion med en av de fyra serotyperna av DENV (DENV-1 till -4) är ofta asymtomatiska eller självbegränsande, har epidemiologiska studier visat att sekundära infektionen av olika serotyper ökar risken för mer allvarliga former av denguefeber. Det är värt att notera att antikroppsberoende förstärkning av DENV infektion som orsakas av icke – eller subneutralizing antikroppar som produceras under den primära infektionen har föreslagits som en potentiell allvarlig denguefeber som inträffade som sekundära infektionen. Det finns dock inga specifika antivirala läkemedel för DENV infektion5.
För utvecklingen av antivirala medel mot DENV är rutin och robusta analyser, som är mottagliga för en hög genomströmning inställning, avgörande för att upptäcka virusreplikation kvantitativt. Konventionellt, har biologiska analyser (t.ex., plack assay) för att kvantifiera smittsamma virus och immunologiska analyser (t.ex., enzymkopplad immunosorbentanalys [ELISA]) för att upptäcka virala antigener använts för att övervaka DENV replikering in vitro- och in-vivo6,7. Dessa analyser är dock ofta mödosamma och kräver flera dagar att utföra, vilket försvårar hanteringen av stora mängder prover. I detta avseende RT-qPCR är en tillförlitlig analys för att upptäcka DENV infektion: det är särskilda, känsliga och relativt snabb7. RT-qPCR tekniken har dessutom fler fördelar i en hög genomströmning format. Dock kräver det typiska förfarandet av RT-PCR RNA virus återvinning av viral nukleinsyra från insamlade prover. Även om olika extraktionsmetoder kan användas för RT-qPCR, behövs flera steg för att erhålla renat viral RNA. RT-qPCR analyser kräver också oftast dyra spin kolumner eller farliga organiska lösningsmedel, vilket gör förberedelseprocessen otympligare. Eftersom att undvika misskötsel eller korskontamination mellan prover är en kritisk faktor för framgångsrik kvantifiering av virala genomer, är en mindre mödosam och tidskrävande metod att föredra, särskilt om den RT-qPCR ska tillämpas på hög genomströmning format.
Vi rapporterar här, en enkel RT-qPCR-procedur för att mäta DENV RNA i en kultur supernatanten av infekterade celler som inte involverar viral RNA rening. Detta optimerade RT-qPCR-protokoll består av två steg: i) inkubering av en supernatant DENV-infekterad cell kultur med en bearbetning buffert, och ii) one-step RT-qPCR på en realtids PCR-instrumentet. DENV RNA i en kultur som supernatant kan därför upptäckas inom 90 min (figur 1). Vi beskriver också tillämpningen av den direkta RT-qPCR för andra RNA-virusinfektioner.
Idag, blir viral nukleinsyra upptäckt av lysrör-baserad realtids-PCR en guld-standard för molekylär diagnos av patogena mänskliga virus, på grund av dess känslighet och snabbhet7. Detta är särskilt viktigt för att bekräfta virusinfektion i den tidiga fasen av akuta infektionssjukdomar såsom denguefeber17. Också, i fältet DNEV grundforskning, RT-qPCR-analys är ett oumbärligt verktyg för övervakning av virusreplikation i in vitro- kultur, vilket kommer att leda till en förståelse för replikering biologi DENV och upptäckten av antivirala hämmare. I denna studie utvecklades lysrör-baserad realtids PCR analysen ytterligare av en kombination av en bearbetning buffert och en one-step RT-PCR reagens så att DENV RNA i kultur supernatanten av infekterade celler kunde kvantifieras av RT-qPCR utan rening viral RNA genomet. Jämfört med rutinmässiga analyser att upptäcka virus replikering, till exempel plack assay, ELISA eller konventionella RTqPCR anställa RNA rening6,7, ett förenklat protokoll hos RT-qPCR-analys resulterade i en stor minskning av tiden och stegen för att kvantifiera DENV RNA. Detta är också en viktig funktion som har fördelar i minimera kontaminering och förlust av genetiska material. Det bör dock noteras att användningen av en ren huva är viktigt i uppbyggnaden av IVT (steg 2.1) och RT-qPCR (steg 4.1 – 4.4) reaktioner på den korskontaminering av amplikon-relaterade produkter eller RNase. Det är också viktigt att hantera kulturen supernatanten, inklusive infektiösa virus, inuti en biosäkerhet skåp (steg 3.3) att minska en laboratorium infektionsrisk.
En annan betydelse av den direkta RT-qPCR-analysen är att ett brett utbud av viral RNA kopior kan analyseras på samma gång utan spädning eller koncentrationen i provet. När ett seriellt utspädda DENV 3′ UTR RNA standard användes, direkt RTqPCR protokollet producerade en linjär standardkurva över sju storleksordningar, och den nedre gränsen för kvantifiering var 500 RNA kopior (figur 2). För detektion av DENV i kultur supernatanten av infekterade celler, 8 x 103 till 8 x 10-2 PFU virus i en 10 μL RTqPCR var inom spänna av DENV 3′ UTR RNA standarden, och den nedersta detektionsgränsen (8 x 10-2 PFU) beräknades för att innehålla 11 , 400 ± 7,077 RNA kopior (figur 3B). Notera, som rapporterats i flera flavivirus studier18,19,20, observerades större förhållandet mellan viral RNA kopior till virus smittsam titer (dvs, PFU) i DENV prover också i denna studie. Denna överskattning antas vara till stor del på grund av defekt (dvs.icke-infektiös) virus eller gratis virus-RNA som är från infekterade och döda celler. Även om förhållandet mellan RNA kopior: PFU erhållit i denna studie (1.1 x 105 till 1,3 x 105 RNA kopior/PFU) var oförenligt med de data som visas tidigare (nyckeltal varierar från 1 till 3 log)21,20, detta kan vara hänföras till skillnaden i virusstammar, celler eller odlingsbetingelser som anställd. En annan sannolik förklaring till avvikelsen är att, eftersom inga RNA reningsprocess var inblandad i den direkta RT-qPCR-analys beskrivs häri, mer DENV RNA i kultur supernatanten kunde ha upptäckts av realtids PCR-analys utan förlust av viral genetiska material.
Enkelheten i den direkta RTqPCR förbättrar förmågan att hantera ett stort antal prover i flera format, till exempel en plattan med 96 brunnar. Därför hjälper detta boende den framtida tillämpningen av den direkta RT-qPCR-analysen till en high-throughput screening-studie för upptäckten av anti-DENV droger. Faktiskt, i detta betänkande, tillämpningen av den direkta RT-qPCR-analysen för validering av en anti-DENV hämmare, MPA, undersöktes och resultatet visade att en IC50 värdet av MPA som erhålls genom den direkta RT-qPCR-analysen (figur 4) var jämförbar med den rapporterats i tidigare studier med plack assay12,13. Detta visar att direkt RT-qPCR är en användbar analys för att på lämpligt sätt utvärdera den hämmande effekten av antivirala medel och kan antas till en drug screening studie i framtiden.
I denna studie gjordes försök att tillämpa den direkt RTqPCR detektering av andra RNA-virus. Som visas i figur 5, när 10-faldig utspädningar av tre andra RNA-virus (YFV CHIKV och MeV) delas in i olika släkten (Flaviviridae, Togaviridaeoch Paramyxoviridae, respektive) undersöktes med hjälp av tidigare sonder rapporterade primers och fluorogenic specifika för de respektiva viral RNA-sekvenserna. Bra korrelationer mellan infektiös titrar och Ct-värden erhölls genom direkta RTqPCR analyser och korrelationerna var 4-6 linjära storleksordningar. Detta tyder på att det direkta RT-qPCR-protokollet är anpassningsbar till olika typer av RNA-virus genom att helt enkelt ändra virus-specifika primers och fluorogenic sonder.
Känsligheten för upptäckt varierade dock bland de virus som testas i denna studie (figur 5). En ändring av protokollet som kan förbättra detektion av mål virus RNA bör vara att använda en ny uppsättning primer/sond sekvenser. Dessutom tros ett viktigt steg för den framgångsrika direkt RT-qPCR-analysen vara effektiv frigöraren av det virala genomet under provet bearbetningssteg (steg 3,1-3,4). Detta skulle vara av särskild betydelse för den kvantitativa detektion av stabila virus såsom en icke-höljebärande virus. Även om som ett förberedande experiment, Coxsackievirus B3 (CVB3), en icke-höljebärande RNA-virus som tillhör Picornaviridae, utsattes till den direkta RT-qPCR-analys med hjälp av tidigare beskrivna CVB3-specifika primers och fluorescerande sonden22, en positiv amplikon signal kunde inte detekteras även med en hög-titer (1 x 105 PFU/mL) virus lager. Detta anses till stor del kan tillskrivas icke-höljeförsedda viruset höga fysiska integritet. Hittills har vissa RT-PCR-analyser som inte kräver rening av nukleinsyra har utvecklats för att upptäcka flera RNA-virus, som sysselsätter olika protokoll i RNA release steg23,24,25, 26. således användning av alternativa (eller ytterligare) behandlingar, såsom en inkubation av ett virus prov vid hög temperatur, potentiellt ökar känsligheten för upptäckt.
Sammanfattningsvis var den direkta RT-qPCR-protokoll som utvecklats i denna studie en enkel och snabb men tillförlitlig metod för att kvantifiera viral RNA i en kultur supernatant av infekterade celler. På grund av denna enkelhet, kunde den direkta RT-qPCR-analysen behandla ett antal prover på kort tid, som innehar löfte för hög genomströmning analys av virusreplikation. Dessutom visades också tillämpningen av protokollet RTqPCR direkt på andra RNA-virus. Denna strategi bör därför vara ett användbart verktyg för att effektivt övervaka de RNA-virus infektionerna i laboratoriemiljö forskning och, eventuellt, i kliniska diagnoser.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Subhash G. Vasudevan (Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore) för den DENV-2 isolera EDEN2 3295 och Shunro Imura (Kobe Quarantine Station, Japan) för YFV 17D vaccinstammen. Författarna är också tacksam mot ledamöterna av Institutionen för mikrobiologi och vårdhygien för deras hjälp. Detta arbete stöds av MEXT KAKENHI Grant nummer JP16737900.
PrimeSTAR Max DNA Polymerase | Takara Bio. Inc | R045A | Comparable PCR reagent kit can be used. |
SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | A24811 | Comparable thermal cycler instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
6x Gel Loading Dye | New England BioLabs | B7024S | Comparable gel loading dye can be used. |
2-Log DNA Ladder | New England BioLabs | N3200 | 0.1-10.0 kilobase pairs. Comparable DNA molecular ladder can be used. |
Gel Scene Tablet | Astec | GST-33 | Comparable gel imaging system can be used. |
illustra GFX PCR Purification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9034-70 | Comparable gel extraction kit can be used. |
BioSpectrometer | Eppendorf | 6135000905 | Comparable spectrophotometer can be used. |
MEGAscrip T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | |
TURBO DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | Included in MEGAscrip T7 Transcription Kit. |
Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio. Inc | 2313A | 40 units/μL |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Comparable RNA purification kit can be used. |
CellAmp Direct RNA Prep Kit | Takara Bio. Inc | 3733Q | |
Proteinase K | Nacalai Tesque | 15679-06 | > 600 units/mL. Comparable reagent can be used. |
iTaq Universal Probes One-Step Kit | Bio-Rad | 1725141 | |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Thermo Fisher Scientific | 4346907 | Comparable plate or tube can be used dependent on the real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Comparable film or optical cap can be used dependent on the real-time PCR plate or tube. |
StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | StepOnePlus-01 | Comparable real-time PCR instrument, but PCR cycle condition needs to be optimized. |