Isolering av vuxna ryggmärgen kärnor för massivt parallella singel-nucleus RNA-sekvensering
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att snabbt isolera högkvalitativa kärnor från färska eller frysta vävnaden för nedströms massivt parallella RNA-sekvensering. Vi inkluderar rengöringsmedel-mekaniska och hypoton-mekaniska vävnad störningar och cell lysis alternativ, som båda kan användas för isolering av atomkärnor.
Abstract
Sondera en enskild cell genuttryck möjliggör identifiering av celltyp och cell staten. Encelliga RNA-sekvensering har vuxit fram som ett kraftfullt verktyg för att studera transkriptionell profiler av celler, särskilt i heterogena vävnader såsom det centrala nervsystemet. Dock kan dissociation metoder krävs för enstaka cell sekvensering leda till experimentella förändringar i genen uttryck och cell död. Dessa metoder är dessutom generellt begränsad till färsk vävnad, vilket begränsar studier på arkivering och bio-bank material. Enda nucleus RNA-sekvensering (snRNA-Seq) är ett tilltalande alternativ för transkriptionell studier, med tanke på att det exakt identifierar celltyper, tillåter studiet av vävnader som är frysta eller svårt att sära på, och minskar dissociation-inducerad transkription. Här presenterar vi ett högt dataflöde protokoll för snabb isolering av kärnor för nedströms snRNA-följande punkter. Denna metod möjliggör isolering av kärnor från färska eller frysta ryggmärgen prover och kan kombineras med två massivt parallella droplet inkapsling plattformar.
Introduction
Nervsystemet består av heterogena grupper av celler som visar en mångfald av morfologiska, biokemiska och elektrofysiologiska egenskaper. Medan den bulk RNA-sekvenseringen har varit användbar för att fastställa vävnad-omfattande förändringar i genuttryck under olika förhållanden, den utgör hinder för detektion av transkriptionell ändringar på enskild cell. Senaste framstegen inom encelliga transkriptionell analysen har aktiverat Klassificering av heterogen celler i funktionella grupper baserat på deras molekylära repertoar och kan även användas för att identifiera uppsättningar av nervceller som hade varit nyligen aktiva. 1 , 2 , 3 , 4 de senaste tio åren har utvecklingen av enstaka cell RNA sekvensering (scRNA-Seq) har möjliggjort studier av genuttryck i enskilda celler, som ger en inblick i celltyp mångfald. 5
Uppkomsten av skalbara metoder såsom massivt parallella scRNA-Seq, har lämnat plattformar till sekvens heterogena vävnader, inklusive många regioner i centrala nervsystemet. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 dock enstaka cell dissociation metoder kan leda till såväl celldöd som experimentella förändringar i genuttryck. 16 senaste arbete har anpassat enda cell sekvenseringsmetoder för att aktivera bevarande av endogena transkriptionell profiler. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 dessa strategier har varit särskilt lämplig för att upptäcka omedelbara tidiga (IEG) genuttryck efter sinnesretning eller beteende. 3 , 4 i framtiden, denna strategi kan också användas för att studera dynamiska förändringar i vävnader i sjukdomstillstånd eller som svar på stress. Dessa metoder, enda nucleus RNA-sekvensering (snRNA-Seq) är en lovande strategi som innebär inte stress-inducerande cell dissociation och kan användas på svårt att separera vävnad (såsom ryggmärgen), samt fryst vävnad. 4 , 17 , 18 , 19 anpassas från tidigare kärnor isoleringsmetoder,20,21,22,23,25 snRNA-Seq vanligtvis använder snabb vävnad störningar och cell lysis under kalla förhållanden, centrifugering och separering av atomkärnor från cellulära skräp. 4 kärnor kan isoleras för nedströms nästa generations sekvensering på flera mikroflödessystem droplet inkapsling plattformar. 4 , 7 , 24 , 25 denna metod möjliggör en ögonblicksbild av tusentals celler transkriptionell verksamhet vid en tidpunkt.
I området i närheten finns det flera strategier för att frigöra kärnor från celler innan isolering och sekvensering, alla med sina egna fördelar och nackdelar. Här, vi beskriver och jämför två protokoll om du vill aktivera isolering av kärnor från vuxna ryggmärgen för de nedströms massivt parallella snRNA-Seq: tvättmedel-mekaniska lysis och hypoton-mekaniska lysis. Tvättmedel-mekaniska lysis ger komplett vävnad störningar och en högre slutliga avkastning av atomkärnor. Hypoton mekaniska-Lys inkluderar en kontrollerbar grad av vävnad störningar, vilket ger en möjlighet för att välja en balans mellan kvantitet och renhet av slutlig kärnteknisk avkastningen. Dessa metoder ger jämförbara RNA avkastning, upptäckta antal gener per kärna och celltyp profilering och också kan både användas framgångsrikt för snRNA-följande punkter
Protocol
Representative Results
Discussion
Det slutliga målet med detta protokoll är att isolera atomkärnor som innehåller högkvalitativa RNA för nedströms transkriptionell analys. Vi anpassat snRNA-Seq metoder för att profilera alla celltyper i ryggmärgen. Vi hittade inledningsvis att typiska cell dissociation metoder var ineffektivt för enstaka cell RNA sekvensering, som ryggmärgen nervceller är särskilt utsatta för celldöd. Dessutom inducerar cell dissociation metoder uttryck av olika aktivitet och stress-och svar gener av upp till flera hundraf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av intramurala programet av NINDS (1 ZIA NS003153 02) och NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Vi tackar L. Li och C.I. Dobrott för deras teknisk support och bra diskussioner, och C. Kathe för granskning av manuskriptet.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- . Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018)
- 10X Genomics. . Single Cell 3′ Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
