Inhibition de protéine inductible et réversible Dominant négatif (DN)

Résumé

Nous présentons ici un protocole visant à développer un système inductible dominant négatif, dans lequel toute protéine peut être inactivée conditionnellement par réversiblement surexprimant une version mutante dominant négatif de celui-ci.

Résumé

Inhibition de protéine dominant négatif (DN) est une méthode puissante pour manipuler la fonction des protéines et offre plusieurs avantages par rapport aux autres approches axées sur la génomique. Par exemple, bien que chimérique et Cre-LoxP stratégies de ciblage ont été largement utilisés, les limitations intrinsèques de ces stratégies (activité du promoteur qui fuit, expression de Cre de mosaïque, etc.) ont considérablement restreint leurs demande. En outre, un effacement complet de nombreux gènes endogènes est une létalité embryonnaire, rendant impossible d’étudier la fonction du gène dans la vie postnatale. Pour relever ces défis, nous avons apporté des changements importants à un protocole de génie génétique précoce et combiné (transgénique) version courte du gène Rb1 avec une protéase lysosomale B procathepsin (CB), générer un modèle de souris DN de Rb1 (CBRb). En raison de la présence d’une protéase lysosomale, la protéine de fusion CB-RB1 entière et son interaction complexe sont acheminés pour dégradation induite par le protéasome. En outre, la présence d’un élément inducteur (rtTA) de tétracycline dans la construction transgénique permet une régulation inductible et réversible de la protéine RB1. La présence d’un promoteur de ROSA-CAG omniprésent dans le modèle de souris CBRb rend un outil utile pour procéder à l’ablation de gène Rb1 transitoire et réversible et de fournir aux chercheurs une ressource pour comprendre son activité dans pratiquement n’importe quel type de cellules où la RB1 est exprimé.

Introduction

La plupart des approches visant à l’ablation des gènes et des protéines s’appuient sur des processus permanents, qui se traduisent généralement par l’élimination complète ou la troncation de la gène, de séquences d’ARN ou protéine d’intérêt (POI). L’objectif général de cette méthode est à l’ingénieur une protéine recombinante pour l’abolition de la fonction des protéines endogènes, sauvage. Nous avons revu et remanié une stratégie alternative^1,2, qui permet l’ablation temporaire d’un POI par inhibition de la DN. Cette méthode fonctionne pour les multimères et peptides monomères mais est plus adaptée pour les p....

Protocole

Génération de la souris transgénique de CBRb et tous les soins aux animaux et expériences liées à l’étude ont été approuvés par l’Université Creighton institutionnels, protection des animaux et utilisation Comité (IACUC) et effectué par des lignes directrices.

1. transgéniques CB-Myc₆-Rb1 Construct

Remarque : Le clonage de CBRb dans un vecteur de pTet_Splice a été fait dans un processus en plusieurs étapes (Figure 1 a et 1 b).

1. Effectuer le premier clonage d’étape dans le Bureau2 + vecteur CB-Myc6.
   1. Pour....

Résultats

En règle générale, concevoir une mutation DN nécessite une quantité considérable d’informations sur la structure et la fonction du POI. En revanche, la stratégie de DN présentée ici est particulièrement utile lorsque les informations structurales et fonctionnelles pour le POI sont limitées. Si le pi est une protéine de multimères, une fusion d’une sous-unité d’une protéase lysosomale peut inhiber principalement les multimères assemblé et, éventuellement, d’autres ligands grâce à une combi.......

Discussion

Afin de contourner les limitations associées à des stratégies traditionnelles de transgéniques, nous avons cherché à créer un modèle de souris dans lequel un POI endogène peut être inactivé conditionnellement en surexprimant une forme mutante de DN de celui-ci d’une manière spatio-temporelle. Pour l’abolition de la fonction de POI endogène, plusieurs options ont été proposées^15,16,17. Nous avons modifié une précédente stratégie .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM	GIBCO-BRL	11965-084
Minimum Essential Medium Eagle, MEME  ;	Sigma  ;	M8042
Sérum fœtal bovin	Sigma  ;	F2442  ;
Lipofectamine  ;	DharmaFECT	T-2010-03
Sal I	Roche	11745622
EcoRV-HF	New England BioLabs	R3195S
NotI	Roche	13090730
CaspaTag  ;	Millipore	APT523
DAPI	Sigma  ;	D9542
Staurosporine	Sigma  ;	S4400
CyQuant NF kit de prolifération cellulaire	Invitrogen	C35007
Rétinoblastome 1 anticorps	Abcam	Ab6075
c-Myc Anticorps	Sigma  ;	M5546
b-actine	Sigma  ;	A5316
Ki-67  ;	Thermofisher scientific	MA5-14520
Phallodin	Thermofisher scientific	A12379
Lecteur de microplaques à fluorescence	FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech
Microscope à épifluorescence  ;	NikonEclipse80i
La gamme de souris TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) est disponible auprès du Jackson Laboratory sous le nom de JAX#032011.  ;