Vi presenterar en visuell guide till sjukdom försvar beteenden i blad-skärning myror, med enskilda klipp och tillhörande definitioner, illustreras i en experimentell infektion scenario. Vårt huvudmål är att hjälpa andra forskare identifiera viktiga defensiva beteenden och att tillhandahålla en gemensam förståelse för framtida forskning på detta område.
Den komplexa livsstilen, evolutionära historia Avancerat samarbete och sjukdom försvar av leaf-skärning myror är väl studerat. Även om många studier har beskrivit de beteenden i samband med sjukdom försvar och associerade användning av kemikalier och antimikrobiella medel, har ingen gemensam visuell referens gjorts. Huvudsyftet med denna studie var att spela in korta klipp av beteenden som är involverade i sjukdomen försvar, både profylaktiskt och direkt riktade mot en antagonist av kolonin efter infektion. Att göra så vi använde en infektion experiment, med sub kolonier av leaf-skärning ant arten Acromyrmex echinatior, och den mest betydande kända patogena hotet myrorna svamp gröda (Leucoagaricus gongylophorus), en specialiserad patogena svampar i släktet Escovopsis. Vi filmade och jämförde infekterade och icke-infekterade kolonier, i både tidiga och mer avancerade stadier av infektionen. Vi kvantifieras viktiga defensiva beteenden över behandlingar och visar att de beteendemässiga Svaren till patogen attack sannolikt varierar mellan olika kaster av arbetstagaren myror och mellan tidiga och sena detektion av ett hot. Baserat på dessa inspelningar som vi har gjort ett bibliotek av beteendemässiga klipp, tillsammans med definitioner av de viktigaste enskilda defensiva beteenden. Vi räknar med att sådan vägledning kan utgöra en gemensam referensram för andra forskare som arbetar inom detta område, att erkänna och studera dessa beteenden, och också ge större utrymme för att jämföra olika studier för att i slutändan hjälpa bättre förstå rollen dessa beteenden spela i sjukdom försvar.
Leaf-skärning myror är avancerade sociala insekter, utgör några av de mest komplexa kolonierna på jorden. De är en härledd gren av svamp växande myrorna (stammen Attini) bestående av de två släkten Acromyrmex och Atta1. De odlar svamp gröda arten Leucoagaricus gongylophorus (basidiesvampar: Agaricales), som de lita på som sin huvudsakliga mat källa2,3. Myrorna leverera denna svamp med färska blad material för sin tillväxt och svampen i gengäld producerar näringsrika svullna hyphal tips (gongylidia) som konsumeras av myrorna och deras barnaskaran. Kolonierna är byggda under jord, svamp grödan bibehålls i externa gardens4,5och ant bönderna skydda sina grödor monokultur från potentiella patogener6,7,8 ,9,10,11,12. Kolonierna dela arbetet mellan arbetstagare av olika storlek (kast) och ålder13,14,15, som sträcker sig till försvar av myror och gröda från patogener.
Vi kan förvänta att blad-skärning Myra kolonier bör vara sårbara för sjukdomen. Grupp levande förväntas underlätta spridningen av sjukdomar mellan omsorgspersonal på grund av täta interaktioner och därmed lättare transmission16. Myrorna är mottagliga för entomopathogenic svamp parasiter, såsom Metarhizium arter och Beauveria bassiana6. Dessa parasiter är generalister och förekommer ofta i marken nära den Bon7,8. Odling av svamp grödan som en monokultur4,gör5 det sannolikt att också vara mottagliga för sjukdomen17,18. Det kan vara infekterade av generalist svamp parasiter (inklusive Aspergillus niger och Trichoderma arter3); dock det mest betydande hotet är en specialist necrotrophic svamp i släktet Escovopsis (Ascomycota: Hypocreales)11. Genom utsöndring av mycolytic enzymer och andra föreningar, Escovopsis dödar och erhåller näringsämnen från svampen gröda12, med potentiellt dödliga konsekvenser för Myra kolonier11,19.
För att bekämpa sjukdomen hot, har myrorna anmärkningsvärda försvar på både individ och kolonin nivå, att kombinera biologisk bekämpning, beteendemässiga och kemiska försvar att agera profylaktiskt och, när nödvändigt, som svar på infektion. Sammantaget dessa försvar förebygga eller minska effekterna av infektioner från både generalist patogener och specialister såsom Escovopsis. De innebär i huvudsak att undvika sammandragning av parasiter i miljö20, hindra parasiter från att ange boet, och begränsa smittspridning inom Bon. De första raderna i försvar inkluderar kemikalier från körtel sekret3,21,22,23,24,25,26, 27 att desinficera växt substrat, genom arbetstagare slicka dem före inkorporeringen i svampen trädgård och myror som utför både själv- och allogrooming. När grooming själva, särskilt vid inträdet boet, kan arbetstagare också gälla sura fekal sekret deras kropp27. Dessa profylaktiska försvar är bevisligen viktig till undvika infektion av patogena hot6,7,8,9,10,11, 12.
Om inledande försvar misslyckas och en patogen som Escovopsis lyckas komma in boet och svampen trädgården, och om infektionen upptäcks tidigt, använder myrorna svampen grooming att ta bort sporer25,28. Myrorna kan tillämpa sekret från metapleural körtlar eller överföra sporer till infrabuccal fickan (en munhålan), där de blandas med en kemisk cocktail som innehåller metapleural och labial körtel sekret26. Det finns mer än 20 kända föreningar i dessa körtlar, inklusive γ – keto-, karboxyl- och indoleactic syror3. Dessa är aktivt tillämpad25, har antibiotika, fungistatisk och svampdödande egenskaper29, och kan hämma Escovopsis spore grobarhet30. Sporer som lagras i infrabuccal ficka utvisas senare utanför den koloni31,32. De flesta av denna svamp grooming efter tidig detektering utförs av mindre arbetstagare28,33. Men om en patogen lyckas undvika upptäckt och sprider inom svampen trädgården, både mindre och större arbetstagare ogräs infekterade delarna svampen28och denna borttagna materialet deponeras utanför boet31. Dessutom art i släktet leaf-skärning Acromyrmex använda biologisk bekämpning i form av antibiotika som produceras av symbiotiska Actinobacteria34,35,36— underhålls på de ant nagelband37huvudsakligen unga stora arbetare34,38,39,40— att producera föreningar som förhindrar mycelial tillväxt av Escovopsis 34 , 38 , 41. denna antibiotika produktion kan i sin tur försämras av Escovopsis-producerade föreningar under en infektion19.
Figur 1: Ant morfologiska egenskaper. En schematisk skiss av en Myra som visar de morfologiska strukturer som nämns i protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Leaf-skärning ant försvar utgör således en integrerad montering av beteendemässiga och kemiska mekanismer som tillsammans ger dessa myror med mycket effektivt skydd mot sjukdom42. Förstå dessa försvar är av stort intresse, och de har varit omfattande forskat16,20,42,43,44. En visuell sammanställning av defensiva beteenden som skulle hjälpa entydig definition och beskrivning av dem för systematisk användning av forskare är dock, att vår kunskap, inte tillgängliga. Även om den terminologi som används för att beskriva ant beteende är relativt standardiserade, är det därför inte säkert att samma beteende gärningar heter konsekvent i olika studier. Här är vårt främsta mål att åtgärda detta genom att ge tydlighet och standardisering genom en sammanställning av videoinspelningar av enskilda profylaktisk och defensiva beteenden tillsammans med tillhörande definitioner. Vi filmade dessa klipp under ett beteende experiment, där vi observerade och kvantifieras beteenden i samband med experimentella Escovopsis infektioner av Acromyrmex echinatior sub kolonierna, vars resultat vi presenterar också här som ett belysande exempel på hur denna sammanställning kan användas för beteendevetenskapliga studier.
Huvudsyftet med denna studie var att observera och registrera karakteristiska leaf-skärning ant defensiva beteenden i närvaro av svamp-garden infektion med Escovopsis, skapa referens clips för använda av bredare forskarsamhället. Det bör noteras att dessa beteenden inte är uteslutande till försvar av kolonier från Escovopsis, men kan också spela en roll i försvaret mot andra föroreningar och infektioner6,7,8,9 ,10,11,12, och i försvaret av myrorna själva42. Våra protokoll ger en bakgrund för bredare forskning om försvar i svamp växande myror. Detta är sannolikt att vara särskilt användbart: (i) för unga forskare som inte är bekant med dessa beteenden; (ii) att säkerställa konsekvent definitioner för och observationer av beteenden; (iii) för att underlätta jämförelser mellan olika studier och ant arter. (iv) eftersom ett antal av dessa beteenden kan inträffa så sällan att även erfarna kan forskare aldrig observerat dem; (iv) eftersom förstå och känna igen beteenden under kontrollerade förhållanden i laboratoriet hjälp studier i situ där förhållandena är svårare att styra.
Resultaten från vår beteendemässiga studie överensstämmer med tidigare arbete som visade att mindre arbetstagare svampen brudgummen — avgörande om en infektion upptäcks tidigt — mer än stora arbetstagare25,28,32. Här, ökat stora arbetare mängden svamp grooming efter Escovopsis infektion (figur 2en). Detta tyder på att mindre arbetstagare är de dominerande svampen groomers, men att större arbetstagare kan hjälpa att förebygga spridningen av mer etablerade infektioner. Större större arbetarna ta bort sporer snabbare, medan mindre arbetare kunde vara mer lämpad för att ta bort mindre tillgängliga sporer. Vi fann också att arbetstagarna framgångsrikt bort sporer i omkring hälften av de smitta sub kolonierna (fyra av nio) när de infördes vid tidpunkten för infektion, och således kunde upptäcka den patogen tidigt (figur 3c). Sammantaget denna pekar på en serie av beteendemässiga Svaren där myrorna först försöka stoppa Escovopsis infektion genom att ta bort sporer (och gör så innan en infektion sprider), snarare än att ta bort delar av svampen trädgården (figur 3a, b. ). Detta förändras över tid om infektionen fortskrider, när myrorna är mer benägna att ta bort delar av den svamp trädgård28. Även våra urvalsstorlekar var för liten för att vara avgörande, och vi kan inte utesluta att samtidiga infektioner inducerad ogräsrensning beteenden, stöder våra data denna trend, med svampen ogräsrensning huvudsakligen att vara närvarande vid senare stadier av infektionen (figur 3 en). De allmänt låga nivåerna av svampen ogräsrensning antyder att myrorna andra försvar (t.ex.kemikalier) brukade ytterligare hämmar tillväxten av Escovopsiseller att ingen av våra experimentella sub kolonier smittades alltför hårt (att göra mer destruktiva försvar onödigt).
Våra fynd tyder på att själv grooming med fekal vätska är kännetecken av myror in svampen trädgården, och används som en profylaktisk åtgärd, i stället för att associeras med en infektion. Liknande observationer har setts i foundress honor som groom sig och överföra fekal droppar med sin mun till deras ben, när du anger boet eller hanterar grödan27. En infektion skulle i teorin öka aktiviteten av arbetstagare vid kanten av svampen trädgården, om det borttagna infekterat materialet utförs samt tappade i avfall högar. Därav, fekal vätska grooming kan också indirekt öka under infektion att minimera sjukdom som sprids. Vi förväntar oss det motsatta mönstret för allvarliga infektioner, med nedsatt rörlighet vid kanten av svampen trädgården, eftersom arbetstagare antingen överge svampen eller anta mer extrema åtgärder såsom kemiska försvar.
Medan fekal vätskor skulle kunna tjäna som ett viktigt profylaktiskt kemiska för individ, används allogrooming av boet-kompisar på andra arbetstagare om de upptäcker främmande partiklar eller mikrober. Den verkliga skillnaden vi observerade mellan frekvensen (tabell 1) av fekal vätska grooming (n = 304) och allogrooming (n = 48) kan tyda på en skillnad i upptäckt av patogen. Myror är inte kunna lätt upptäcka patogener på sig själva med sina antenner; allogrooming görs å andra sidan genom boet-mates, som kan inspektera hela kroppen av en myra och bara välja att brudgummen vid behov. Eftersom Escovopsis är en parasit svamp trädgården i stället för myrorna, kan detta också förklara den låga mängden allogrooming.
Vi observerade sällan metapleural körteln grooming, och endast i senare skeden av infektion. Arter av svamp växande myror med riklig Pseudonocardia bakteriell täcka brudgummen metapleural körtlar mindre än arter med mindre eller ingen täcka25,47. Som A. echinatior har ett överflöd av den symbiont47, kan detta förklara den låga körteln grooming frekvens. Metapleural körtel secretionen är också dyrt att producera30, och kan lagras inom infrabuccal fickan för längre tid, vilket innebär att behovet av grooming metapleural körtel kan vara ovanliga. Under metapleural körteln grooming, myrorna samtidigt växla ben och slicka benet som hade bara tränas körteln; sporer överförs därmed till infrabuccal fickan, där körtel sekret är avgörande för att hämma Escovopsis‘ potential för efterföljande groning25. Mindre arbetstagare är mer rikligt inuti boet och har större metapleural körtlar per enhet kropp massa30, tyder på att de är ansvariga för huvuddelen av metapleural körtel sekret. Detta skulle också förklara varför, i vår studie, den högsta frekvensen av svampen grooming var bland mindre arbetare.
Vi förväntas iaktta behavior(s) indikerar aktiv användning av antibiotika från den bakteriella symbiont Pseudonocardia, vanligen observerats på nagelbanden Acromyrmex arbetstagare och känd för att spela en roll i försvar mot Escovopsis 36 , 39 , 40. den mest sannolika förklaringen för att inte observera sådant beteende, är att tillämpningen av dessa antibiotika kan införlivas i andra beteenden, som själv grooming följt av svampen grooming eller ogräsrensning, som kan göra det svårt att följa som en distinkta beteende.
Vi observerade ovanliga beteende regurgitating flytande droppar vidare till svampen trädgården. Uppstötningar av mat för nestmates har tidigare beskrivits i blad-skärning myror22. I vårt experiment, droppar skilde sig i färg från transparent till mörkbrun, föreslår de får en näringskälla för andra myror eller ge vatten. Vi observerade endast två tillfällen där andra myror drack från droppar, så att vi inte kan avgöra om droppar gynna andra myror eller servera att rehydrera svampen När luftfuktigheten är låg. De flesta observationer av detta beteende var under Escovopsis infektioner, vilket kan innebära en defensiv roll, såsom immun priming av uppstötningar av antimikrobiella peptider16,48. Vi kan inte dra några säkra slutsatser om detta eftersom problemet var sällsynt, men det skulle vara en intressant linje att undersöka vidare, till exempel genom att fastställa huruvida droppar har antimikrobiella egenskaper.
Med tanke på att observationsstudier av komplexa defensiva beteenden av leaf-skärare myror, inklusive någon jämförelse med och utan trädgård infektion, skulle vara extremt svårt att göra i fältet, experimentella data kan ge värdefulla insikter i dessa beteenden under mer kontrollerade förhållanden. Medan de iakttagelser som gjorts under laboratorieförhållanden kan skilja sig från de beteenden som finns under naturliga förhållanden, verktyg såsom vår katalog av viktiga defensiva beteenden behöver utvecklas, för att förbättra både experimentell och fältet studier i framtiden. Den experimentella metoden kan dock delvis förklara varför vissa beteenden var extremt sällsynta (t.ex. allogrooming, metapleural körteln grooming) i vår demonstration av att använda dessa beteendemässiga definitioner. Framtida studier kan därför överväga begränsningar i detta experiment, att hitta sätt att göra mer naturlig observationer. Ytterligare faktorer kan också integreras i det nuvarande protokollet, till exempel skilja mellan Actinobacteria-bär (yngre) och äldre arbetstagare med mindre riklig lock, som kan svara annorlunda på hotet om en Escovopsis infektion. Det finns kompromisser mellan att göra observationer mer korrekt (till exempel genom poängsättning fokal individer), eller som har större sub kolonin storlek (större antal arbetstagare) och mängden tid eller antal sub kolonier eller individer som kan filmas på en given peka i tid. Dock fokuserade set-up skulle kunna utvidgas för större beteendevetenskapliga studier med fokus på att åtgärda en beteendevetenskaplig mål, i detta fall vi på framgångsrikt skylta en metod för registrering och definiera specifika defensiva beteenden.
Vi dokumenterade beteenden som bidrar till försvar i blad-skärning myror och mer påtagligt, har systematiskt identifieras, beskrivs och fångas defensiva beteenden på film. Våra representativa resultat förstärka annan forskning inom detta område tyder på varför det är svårt för en patogen att framgångsrikt angripa svamp-jordbruk Myra kolonier, när inför en omfattande uppsättning defensiva beteenden och associerade tillämpningen av antimikrobiella föreningar. Vårt huvudsakliga mål var att ge ett nytt verktyg för framtida arbete på detta område, och vi hoppas att beteendemässiga katalogen kommer att vara värdefulla för att säkra samstämmighet och strömlinjeformad definitioner, observationer och tolkningar av beteenden, att fungera som en viktig resurs för framtida forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka linje Vej Ugelvig och Kirsten Sheehy för användbar diskussioner kring grooming mekanismer av antenn städare och filmning set-up. Michael Poulsen stöds av en Villum Kann Rasmussen Young Investigator Fellowship (VKR10101) och Tabitha Innocentius av en Marie Curie enskilda Europeiska gemenskap (IEF bevilja 627949). Vi vill också tacka the Smithsonian Tropical Research Institute för användning av faciliteter och logistiskt stöd i Panama och Autoridad Nacional del Ambienten om tillstånd att samla in och exportera myror till Danmark.
Plastic boxes | N/A | N/A | Transparent. Length: 3.15 in (8 cm), width: 2.17 in (5.5 cm), depth: 1.77 in (4.5 cm) |
Petri dishes | Sarstedt | 82.1472 | 3.62×0.63 in (9.2×1.6 cm) |
Inoculation loops | Labsolute | 7696431 | Disposable 1uL. Length: 7.67 in (19.5 cm) |
Cameras | DBPower | NTC50HD_8.5mm | USB Endoscope Camera |
Holders for the cameras | N/A | N/A | Old beaker clamp stand. |
Laptop | HP | N/A | Generic laptop for saving recordings. |
Program used on the laptop | Windows Movie maker | N/A | |
Forceps | Vermandel | 50.054 | Soft |
Potato dextrose broth | Sigma-Aldrich | P6685-1KG | 24 g/L |