Denne protokollen beskriver bruken av plast sjetonger for kultur og fordeler primære murine neurons. Disse brikkene er prefabrikkerte, brukervennlig og kompatibel med høy oppløsning, lever, og fluorescens bildebehandling. Denne protokollen beskriver hvordan plate rotte hippocampus nerveceller i disse brikkene og utføre fluidic isolasjon, axotomy og immunostai.
Microfabricated metoder å fordeler neurons har blitt viktige verktøy for mange neuroscientists. Denne protokollen beskriver bruken av en kommersielt tilgjengelig ferdigmontert plast chip for compartmentalizing kulturperler primære rotte hippocampus neurons. Disse plast sjetonger i fotavtrykk av en standard microscope skyve, er kompatibel med høy oppløsning, lever, og fluorescens bildebehandling. Denne protokollen demonstrerer hvordan du retrograd etiketten neurons via isolert axons bruker en modifisert rabiat virus koding et fluorescerende protein, opprette isolerte microenvironments i et rom og utføre axotomy og immunocytochemistry på prosessoren. Neurons er kultivert > 3 uker i plast sjetonger, illustrerer kompatibiliteten til disse brikkene for langsiktig neuronal kulturer.
Tradisjonelle Nevron kultur tilnærminger resulterer i tilfeldig utvekst av axons og dendrites, hvilke forhindre studiet av nerveceller i deres unike polarisert morfologi. Microfabricated multicompartment enheter har blitt veletablerte og godt brukt forskningsverktøy for nevrologer i de siste 10-15 årene (høyprofilerte publikasjoner er refererte1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17). disse enhetene fordeler nevroner og en metode for å fysisk og kjemisk manipulere subcellular regioner av neurons, inkludert somata, dendrites, axons og synapser18,19. De tilbyr også flere eksperimentelle paradigmer som ikke er mulig å bruke tilfeldige kulturer, inkludert studier av axonal transport, axonal proteinsyntese, axon skade/regenerasjon og axon til soma signalering. 2 delt grunnkonfigurasjon består av to parallelle microfluidic kanaler med en rekke mindre vinkelrett microgrooves. Primær eller Stamcelle-avledet neurons er belagt i en av microfluidic kanalene, utligne og feste til bunnen av enheten og utvide neurites i løpet av dager. Mange veksten kjeglene finner veien inn i microgrooves, som er små nok til at de hindrer cellen legemer inn. Fordi veksten kjeglene er fysisk begrenset og ikke å snu i microgrooves, vokser de rett inn i det tilstøtende rommet (axonal rom) hvor de er isolert.
Historisk er disse enhetene har blitt formet med poly(dimethylsiloxane) (PDMS) fra en photolithographically mønstrede master mold og laget i-huset i etterforskere laboratorier eller kjøpt kommersielt. En av de viktigste ulempene med å bruke PDMS er dens hydrophobicity20. PDMS gjøres hydrofile midlertidig, men deretter blir raskt hydrofobe innen timer i en ikke-vandig miljø20. Derfor må enhetene knyttes til et glass dekkglassvæske eller andre passende substrat ved bruk. Ferdigmontert plast multicompartment sjetonger er nå kommersielt tilgjengelig (f.eksXonaChips) i sprøytestøpt plast. Disse brikkene er laget permanent hydrofile, forenkle enheten wetting og la før monteringen av chip med en tynn film av syklisk olefiner copolymer (COC) sette microfluidic kanalene på bunnen. Disse brikkene er fabrikkert i en optisk gjennomsiktig plast egnet for høy oppløsning fluorescens bildebehandling.
Formålet med denne protokollen er å demonstrere bruk av chips ferdigmontert plast microfluidic for flere eksperimentelle paradigmer utføres med murine hippocampus eller kortikale neurons. Denne protokollen beskriver hvordan retrograd etiketten neurons bruker en modifisert rabiat virus innen chip. Axotomy for studier av axon skade og gjenfødelse er også beskrevet. Til slutt viser denne protokollen hvordan du utfører fluorescens immunostaining med enheten.
Plast sjetonger for multicompartment gir en lett-å-bruke alternativet for compartmentalizing neurons, gir langsiktig neuronal kulturer (> 3 uker). Denne protokollen detaljer hvordan kultur kortikale og hippocampus murine nerveceller i disse brikkene. Etableringen av løselig microenvironments og hvordan retrograd etiketten nerveceller, utføre axotomy og utføre immunocytochemistry ble også diskutert. Viktigere, disse prosessorene er kompatible med høy oppløsning, fluorescens og live bildebehandling.
Plast multicompartment sjetonger gi mange av de samme funksjonene som de PDMS-baserte compartmentalized enhetene, men har fordeler, ulemper og noen særtrekk. Tabell 1 gir en Funksjonssammenligning av både plast chip og PDMS-baserte enheter. Først og fremst er flisen ferdig montert og gjort permanent hydrofile, som forenkler wetting, noe som gjør dem enklere å bruke. Plasten er ikke gass permeabel, i motsetning til PDMS, så hvis bobler uventet danner innenfor kanalene, de ikke lett rømme og må fjernes. En pre belegg løsning som inneholder hovedsakelig etanol og noen andre proprietære agenter eliminerer boble formasjon.
Live bildebehandling av projeksjoner følgende signaltransduksjon fluorescerende proteiner ble utført i chips (Figur 4) og det var ingen synlig autofluorescence av plast. En påminnelse er at nedsenking oljer brukes med chip for høy numeriske blenderåpning mål må være silikonolje basert og ikke mineralolje basert. Mineralolje kan føre en motsatt reaksjon med syklisk olefiner copolymer. For brightfield avbildning, er det viktig å merke seg at microgrooves i chip avrundes i endene og det er en gradvis overgang av z-retningen for den viktigste kanalene mot Mikrokuttspor barrieren forårsaker noen lys brytning i hver ende av den microgrooves i løpet av brightfield imaging (Figur 3). Chip er ferdigmontert, antistoff gjennomtrengning i mikron-størrelse-microgrooves kan være ujevn (som med permanent limt PDMS-baserte enheter); Dermed skal kvantitativ analyse etter immunostaining utføres i kanaler/seksjonene. Immunostaining av neuronal anslag i microgrooves kan forbedres ved å opprette en volumforskjellene mellom seksjonene å hjelpe flyten av antistoffer og fluorophores i microgrooves.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter tekniske eller innholdsmessige assistanse fra Taylor Wilt (Xona), Smita Paranjape (UNC Chapel Hill), Joyce Ciechanowski (Xona) og Brad Taylor (Xona). Forfatterne bekrefter støtte fra Xona Microfluidics, LLC og National Institute of Mental Health (R42 MH097377). Bildebehandling ble delvis støttet av Confocal og Multiphoton Imaging Core anlegg av NINDS Center Grant P30 NS045892 NICHD Center Grant (U54 HD079124). Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC150 | 150 µm length microgroove barrier |
Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier | |
Xona Microfluidics, LLC | XC900 | 900 µm length microgroove barrier | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaPDL | Xona Microfluidics, LLC | XonaPDL | |
E17/E18 timed pregnant Sprague Dawley rats | Charles River | 24100564 | |
neuronal culture media: | |||
– Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
-B-27 Plus Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | A3582801 | |
-GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
-Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-mCherry | Material Transfer Agreement required | |
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Pierce 16% formaldehyde | ThermoFisher Scientific | 28906 | |
PBS (10x) | ThermoFisher Scientific | QVC0508 | |
normal goat serum | ThermoFisher Scientific | 16210064 | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
Spinning disk confocal imaging system | Andor Technology | CSU-X1, iXon X3 EMCCD | 60x silicone oil & 20x objectives |
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |