Summary
Hier beschreiben wir 3 Erwachsene Zebrafisch-Verletzung-Modelle und ihre kombinierte Nutzung mit immunsuppressiven medikamentösen Behandlung. Wir betreuen über Bildgebung Gewebe zu regenerieren und Mineralisierung der Knochen darin erkennen.
Abstract
Zebrafisch sind in der Lage, verschiedene Organe, einschließlich Anhängsel (Flossen) nach Amputation zu regenerieren. Dazu gehört die Regeneration von Knochen, die innerhalb von etwa zwei Wochen nach der Verletzung nachwächst. Darüber hinaus Zebrafisch sind in der Lage zu heilen Knochen schnell nach Trepanation des Schädels, und reparieren Sie Brüche, die in Zebrafisch knöchernen Fin Strahlen leicht eingeführt werden können. Diese Verletzungen Assays repräsentieren machbare experimentelle Paradigmen, die Wirkung der verabreichten Medikamente auf die Bildung von Knochen schnell zu testen. Hier beschreiben wir die Verwendung dieser 3 Verletzungen-Modelle und ihre kombinierte Nutzung mit systemischer Glukokortikoid-Behandlung, die Knochen hemmenden und immunsuppressive Effekte ausübt. Wir geben einen Workflow zur immunsuppressiven Behandlung bei Erwachsenen Zebrafisch vorzubereiten, veranschaulichen, wie Fin Amputation, Trepanation von calvarial Knochen und Fin Frakturen, durchführen und beschreiben, wie der Einsatz von Glukokortikoiden beeinflusst beide Knochen bilden Osteoblasten und Zellen der Monocyte/Makrophagen-Linie als Teil der angeborenen Immunität im Knochengewebe.
Introduction
Zebrafisch stellen eine leistungsfähige Tiermodell vertebrate Entwicklung und Krankheit zu studieren. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass sie sind kleine Tiere, die sehr gut zu züchten und dass ihr Genom vollständig sequenziert und Manipulation1zugänglich ist. Weitere Vorteile sind die Möglichkeit, weiterhin live Bildgebung in den verschiedenen Phasen, einschließlich der in-Vivo Bildgebung von Erwachsenen Zebrafisch2und die Fähigkeit zur Hochdurchsatz-Drogen-Bildschirme im Zebrafisch-Larven-3durchführen. Darüber hinaus Zebrafisch besitzen eine hohe Regenerationsfähigkeit in einer Vielzahl von Organen und Geweben, einschließlich Knochen und dienen damit als ein nützliches System Skelett Krankheit zu untersuchen und reparieren4,5.
Glukokortikoid-induzierte Osteoporose (GIO) ist eine Erkrankung, die aus langfristigen Behandlung mit Glukokortikoiden, zum Beispiel im Zuge der Behandlung von Asthma oder rheumatoider Arthritis Autoimmun-Krankheit resultiert. GIO in etwa 30 % der Glukokortikoid-behandelten Patienten entwickelt und stellt ein großes gesundheitliches Problem6; Daher ist es wichtig, den Einfluss der Immunsuppression auf Knochengewebe im Detail zu untersuchen. In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl von Zebrafisch-Modelle, die der Umgang mit der Pathogenese der GIO entwickelt. Glukokortikoid-vermittelten Knochenabbau wurde im zebrafischlarven, z. B. induziert die zur Identifizierung der entgegenwirkenden Verbindungen, die Erhöhung der Knochenmasse bei einer Droge Bildschirm7geführt. Darüber hinaus haben Glukokortikoid-induzierte Knochen hemmende Effekte nachgeahmt worden Zebrafisch skaliert in Vitro und in Vivo8,9. Diese Tests sind sehr überzeugende Ansätze, vor allem wenn es darum geht, die Identifizierung von neuartigen immunsuppressive und Knochen Anabolika. Jedoch nur zum Teil berücksichtigt das Endoskelett und haben in einem regenerativen Kontext nicht vorgetragen. So lassen sie nicht die Untersuchung der Glukokortikoid-vermittelten Effekte während der schnellen Modi der Erwachsenen, regenerative Knochenbildung.
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll Forscher um Glukokortikoid-vermittelten Effekte auf Erwachsene Zebrafisch Knochen in der Regeneration zu studieren. Verletzungen-Modelle beinhalten teilweise Amputation der Zebrafisch Schwanzflosse, Trepanation des Schädels sowie die Schaffung von Fin Ray Frakturen (Abbildung 1A-1 C) und werden kombiniert mit Glukokortikoid Exposition über Inkubation (Abbildung 1E ). Wir haben vor kurzem einen Teil dieses Protokolls verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber Prednisolon, eine der am häufigsten verschriebenen Kortikosteroide Drogen auf Erwachsene Zebrafisch regenerierende Fin und Schädel Knochen10beschreiben. Im Zebrafisch führt Prednisolon Verwaltung zu verminderter Osteoblasten Proliferation, unvollständige Osteoblasten Differenzierung und schnelle Induktion der Apoptose in der Monocyte/Makrophagen Linie10. In diesem Protokoll beschreiben wir auch wie Frakturen in einzelnen knöchernen Fin Ray Segmente11, eingebracht werden können wie dieser Ansatz nützlich sein kann, wenn Glukokortikoid-vermittelten Effekte auf Knochen auftritt während der Fraktur Reparatur zu studieren. Die hier vorgestellten Methoden werden dazu beitragen, weitere Adresse, die zugrunde liegenden Wirkmechanismen Glukokortikoid bei der Regeneration von Knochen schnell und können auch in anderen Situationen der systemischen Arzneimitteln im Rahmen der Zebrafisch Geweberegeneration eingesetzt werden.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Landesdirektion Dresden genehmigt (Genehmigungsnummern: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1 / 5131/354/87).
1. Vorbereitung von Materialien und Lösungen
Hinweis: Prednisolon, führt wie andere Glukokortikoide zur Immunsuppression. So muss Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um Infektionen bei behandelten Tieren während des Versuchs zu vermeiden. Zu diesem Zweck, Autoklaven Glaswaren und "Fisch Wasser" (d.h., das Wasser, das verwendet wird, um Erwachsenen Zebrafisch hinten) vor Beginn des Experiments.
- Berechnen Sie die Anzahl der Zebrafisch im Experiment verwendet werden. Achten Sie darauf, die Personen gehören, die als Kontrollen dienen.
- Autoklaven 600 mL Glas Becher, die mit Aluminium-Folie mit Autoklav Klebeband abgedeckt werden. Zebrafisch individuell behandelt werden, so ist 1 Becherglas pro Zebrafisch erforderlich.
- Berechnen Sie die Höhe der Fischwasser für das Experiment benötigt. 300 mL sind pro Person und Tag. Berücksichtigen Sie die Dauer des Experiments (z. B. 1 Woche/7 Tage).
- Füllen Sie Glasflaschen mit Fischwasser, schließen sie und Autoklaven die Flaschen mit Autoklav Klebeband. Im Idealfall verwenden Sie 2 L Flaschen, aber andere wie 1 L oder 5 L-Flaschen können auch verwendet werden.
Hinweis: Wenn Experimente lang sind (z. B. 4 Wochen/28 Tage) und die Höhe von Glasflaschen ist begrenzt, achten Sie darauf, mindestens mehrere Tage hintereinander Flaschen vorbereiten und wiederholen den Vorgang (1,3 bis 1,4) während des Experiments. - Bereiten Sie eine Prednisolon-Stammlösung von 100 mM steril filtriert Prednisolon in Dimethylsulfoxide (DMSO). Den Bestand in 1 mL oder 2 mL Microcentrifuge Schlauch Aliquote einfrieren.
Achtung: Immer tragen Schutzkleidung beim Arbeiten mit Prednisolon (Schutzhandschuhe, Schutzbrille, Kittel). - Am ersten Tag des Experiments bereiten Sie Inkubation Lösungen mit Prednisolon und DMSO vor, bzw.. Tauen Sie zu diesem Zweck die erforderliche Menge an 100 mM Prednisolon-Stammlösung und autoklaviert Fischwasser an eine Endkonzentration von 50 µM fügen Sie Prednisolon hinzu.
- Fügen Sie für die Behandlungen die entsprechende Menge DMSO autoklaviert Fischwasser hinzu. Als Beispiel um 2 L Prednisolon mit Fischwasser zu produzieren, fügen Sie 1 mL 100 mM Prednisolon Lager auf 2 L Wasser. Fügen Sie in einem anderen 2 L Flasche Fischwasser 1 mL DMSO, entsprechend.
- Arbeiten Sie an einem geeigneten Ort, der festgelegt ist, medikamentöse Behandlungen, durchführen im Idealfall in einem Raum bei 27 ° C.
2. Generation von Verletzungen im Zebrafisch flossen
Hinweis: Um Knochen im Zebrafisch flossen verletzen, Resektion der Flosse (Amputation, in der Regel in der Schwanzflosse) durchführen oder Bruch von einzelnen knöchernen Fin Strahlen (Fraktur-Modell). Betäuben Sie zu diesem Zweck Erwachsene Zebrafisch zuerst.
- Amputation
- Um Erwachsene Zebrafisch betäuben, bereiten Sie einen Durchmesser von 100 mm Petrischale mit 0,02 % MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoate Methanesulfonate) in Fischwasser (dieses Wasser muss nicht autoklaviert werden).
- Übertragen Sie ein Zebrafisch zu einem Zeitpunkt auf der MS-222 enthaltende Petrischale mit einem Fischnetz und inkubieren Sie es, bis es auf der Seite ohne Bewegung liegt und reagiert nicht auf Berührungen. Testen Sie letzteres durch Berühren der Afterflosse mit stumpfen Pinzette.
- Warten Sie, bis 4 Anästhesie erreicht ist, die die entsprechende Ebene für Fin Resektion12ist. In dieser Phase sinkt die Rate der Kiemendeckel Bewegung, Muskeltonus ist verloren und der Fisch bewegt sich nicht auf Touch12.
- Nehmen Sie stumpfe Pinzette und übertragen Sie die narkotisierter Zebrafisch sorgfältig auf die umgekehrte Deckel 100 mm Petrischale. Legen Sie der Zebrabärbling auf die laterale Seite. Stellen Sie sicher der Zebrabärbling immer in der gleichen Ausrichtung, zum Beispiel auf ihrer rechten Körperseite liegen. Resezieren Sie mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge 50 % der Flosse (Abbildung 1A, 2A).
Hinweis: Die Geschwindigkeit der Zebrafisch Fin Regeneration hängt die Menge des resezierten Fin Gewebes, d. h. mehr Fin Gewebe reseziert wird, desto schneller regeneriert sich die Flosse13. So unbedingt zur Minimierung von Variationen in Fin Regeneration immer die Flosse auf dem gleichen Niveau in allen Zebrafisch resezieren. - Übertragen Sie die verletzten Zebrafisch auf eine autoklaviert Glas Becher mit 300 mL Prednisolon oder DMSO wasserhaltigen autoklaviert Fisch. Decken Sie das Becherglas mit Alu-Folie, Flucht der Zebrafisch zu vermeiden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2, 2.1.3, bis die erforderliche Anzahl von Zebrafisch für das Experiment erreicht ist.
- Um Erwachsene Zebrafisch betäuben, bereiten Sie einen Durchmesser von 100 mm Petrischale mit 0,02 % MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoate Methanesulfonate) in Fischwasser (dieses Wasser muss nicht autoklaviert werden).
- FIN-Fraktur
- Bereiten Sie eine Agarose-beschichtet 100 mm Petrischale durch Erhitzen eine 2 % Agarose-Lösung in Fischwasser oder E3 (Embryo Medien 3, 50 mM Natrium-Chlorid, 0,17 mM Kaliumchlorid, Calciumchlorid 0,33 mM 0,33 mM Magnesium-Sulfat). Gießen Sie vorsichtig ca. 10 – 15 mL der Lösung in der Petrischale. Der Boden der Schale sollte komplett bedeckt sein. Lassen Sie die Agarose erstarren.
- Betäuben Sie Zebrafisch, wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
- Stumpfe Pinzette nehmen und betäubt Zebrafisch sorgfältig auf die Agarose-beschichtet 100 mm Petrischale übertragen. Legen Sie der Zebrabärbling auf die laterale Seite. Unter dem Mikroskop Dissektion der Schwanzflosse vollständig zu identifizieren deutliche knöcherne Fin Strahlen und fin Ray Segmente zu verbreiten. Stellen Sie sicher der Zebrabärbling immer in der gleichen Ausrichtung, zum Beispiel auf ihrer rechten Körperseite liegen.
- Stellen Sie mit einer Injektionsnadel (0,3 x 13 mm) eine Fraktur in der Mitte eines knöchernen Fin Ray Segments (Abbildung 1 b). Um dies zu tun, wird die Nadel leicht auf das Segment gedrückt, bis ein Riss (Pfeil in Abb. 2 b) erscheint. Während sanfte Druck führt um zu Bruch des nur eines der beiden gegnerischen Hemirays stärker wird Druck zum Bruch beider Hemiray-Segmente führen.
- Führen Sie zu viele Frakturen in Flossen, nicht ein, da dadurch Stabilität der Finne stark beeinträchtigt wird. Gelten Sie als Anregung Frakturen nur in 3 bis 5 Fin Strahlen.
- Produzieren Sie Frakturen in entsprechenden Segmenten immer über verschiedene Fin Strahlen und Zebrafisch, zum Beispiel im Strahlen der Rückenflosse 3, 7 (oder 8) und ventralen Fin Ray 3. Die proximalen distale Höhe der Fraktur ist ideal bei 3 Segmente proximal zu den Fin Strahlen Gabelung Punkt 11.
- Übertragen Sie die verletzten Zebrafisch auf eine autoklaviert Glas Becher mit 300 mL Prednisolon oder DMSO wasserhaltigen autoklaviert Fisch. Decken Sie das Becherglas mit Alu-Folie, Flucht der Zebrafisch zu vermeiden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2 zu 2.2.5, bis die erforderliche Anzahl von Zebrafisch für das Experiment erreicht ist.
3. Generation der Calvarial Schädel Verletzungen (Trepanation)
Hinweis: Die Calvariae im Zebrafisch sind Homolog zu calvarial Knochen bei Säugetieren. Diese exoskeletal Knochen14 stellen somit, ein Gewebe von besonderem Interesse bei der Untersuchung der Pathogenese von GIO. Um den Schädel zu verletzen, wird Trepanation durch Bohren eines Loches in der Os Os Parietale (Abbildung 1, 2 C) oder mit Hilfe von einem Microdrill11durchgeführt.
- Betäuben Sie der Zebrabärbling gemäß Ziffer 2.1.
- Halten Sie den narkotisierten Zebrafisch aufrecht mit der Pinzette, so, dass die calvarial Knochen gut sichtbar unter dem Mikroskop Dissektion von oben (Abbildung 1).
- Suchen Sie die rotierenden Microdrill in der Mitte des Stirnbein (Os Frontale) und tippen Sie auf die Knochen. Das erzeugte Loch ist von der Größe der Microdrill-Grat (500 µm, Abbildung 2, Abb. 3 b).
Hinweis: Achten Sie darauf, nicht die Microdrill seitlich bewegen, während die Herstellung der Verletzung. Sofort der Widerstand des Knochens plötzlich fällt beenden. Alle nicht weiter Bohren, sonst das Gehirn werden beschädigte 15. - Übertragen der verletzten Zebrabärbling zu einem Käfig mit Fischwasser gefüllt, bis es vollständig aus der Narkose erholt. Beobachten Sie genau.
- Übertragen Sie die verletzten Zebrafisch auf ein Fischwasser plus Prednisolon oder DMSO enthaltenden Glasgefäß.
4. Behandlung der Zebrafisch während der Inkubation
Hinweis: Während der Anwendung von Prednisolon/DMSO, das Medikament mit Fischwasser täglich gewechselt werden muss, und Zebrafisch müssen regelmäßig gefüttert werden.
- Wasserwechsel
- Zum Austausch der Fischwasser, tauen 100 mM Prednisolon Lager und bereiten die erforderliche Menge von 50 µM Prednisolon in autoklaviert Fisch Wasser frisch jeden Tag die Behandlungsdauer. Bereiten Sie DMSO wasserhaltigen Fisch für die Kontrolle Zebrafisch entsprechend vor.
- Nehmen Sie ein Glasgefäß mit einem einzigen untergebracht Zebrafisch Inkubation Lösung und übertragen Sie die Lösung einschließlich der Zebrabärbling in einen geeigneten Behälter, zum Beispiel einem zeitlichen Gehäuse Käfig.
Hinweis: Immer behandelt Verwendung separate interim Container für Prednisolon und DMSO Zebrafisch, bzw., um sicherzustellen, dass DMSO Kontrolle Zebrafisch nicht ausgesetzt und Prednisolon. - Füllen Sie das Becherglas mit frischen Droge mit Fischwasser (300 mL).
- Übertragen Sie der Zebrabärbling aus dem Interims-Container auf das Glasgefäß mit frischen Inkubation Lösung mit einem Fischnetz. Setzen Sie wieder die Folie um den Zebrafisch zu vermeiden.
- Wenn die Zeit des Experiments 2 Wochen überschreitet, tauschen Sie die Glas-Becher.
- Fütterung
- Während der kurzen Behandlungen (für bis zu 2 Tage) nicht füttern Sie Zebrafisch. Während der längeren Experimente feed Zebrafisch. Besondere Vorsicht zur Vermeidung von Umweltbelastungen der Inkubation Lösung. So füttern Sie mit Artemia SSP anstatt mit Flockenfutter und nur an jedem zweiten Tag.
Hinweis: Artemia werden regelmäßig verwendet, um junge Zebrafisch füttern, und sollte im Zebrafisch haltering Gerät verfügbar sein.- Etwa füttern 2 h vor das Fischwasser ausgetauscht wird, Zebrafisch mit Artemia Ssp in ihrem Glas Becher. Hierzu verwenden Sie eine plastische-Pipette und Vorschub 0,5 bis 1 mL der geschlüpften Artemia Lösung pro Glasgefäß.
- 2 h warten Sie und tauschen Sie die Inkubation Lösung mit frischen Droge mit Fischwasser gemäß Ziffer 4.1.
- Während der kurzen Behandlungen (für bis zu 2 Tage) nicht füttern Sie Zebrafisch. Während der längeren Experimente feed Zebrafisch. Besondere Vorsicht zur Vermeidung von Umweltbelastungen der Inkubation Lösung. So füttern Sie mit Artemia SSP anstatt mit Flockenfutter und nur an jedem zweiten Tag.
5. Analysen von Proben
Hinweis: Nach der Inkubation des verletzten Zebrafisch Prednisolon und DMSO mit Fischwasser bzw. Analysen Sie Knochen Mineralisierung/Verkalkung (5.1 bis 5.3) oder live Imaging Zebrafisch unter dem Mikroskop Dissektion (5.4) durchführen 10,11,16. Verwenden Sie live imaging Fin regenerieren Länge zu bestimmen und zu erkennen, Unterschiede in der Genexpression Reporter in transgenen Zebrafisch.
-
Fixierung des Gewebes von Interesse
- Zur Fixierung von Flossen und/oder Schädel 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS vorbereiten und Einfrieren bei-20 ° C für die Lagerung. Verwendung frisch zubereitete 4 % PFA in PBS oder Tauwetter die erforderliche Menge vor dem Gebrauch. Alternativ 2 % PFA mit PBS-Puffer verwendet werden.
Achtung: PFA ist giftig und sollte vorsichtig behandelt werden, unter einer Abzugshaube. Tragen Sie Schutzkleidung. - Zur Fixierung der Flossen bereiten eine kleine Petrischale (z. B. 30 mm) mit kalten 4 % PFA mit PBS-Puffer und stellen Sie sicher, dass der Boden der Schale voll abgedeckt ist. Zur Fixierung von Schädeln, bereiten Sie ein kleines Glas mit Deckel oder ein Rohr mit kalten 4 % PFA mit PBS-Puffer.
Achtung: Griff PFA mit Lösungen nur unter dem Abzug, da es giftig ist. Tragen Sie Schutzkleidung. - Das Gewebe des Interesses zu ernten.
- Regenerierende ernten Fin Gewebe oder flossen mit Frakturen Betäuben der Zebrabärbling gemäß Ziffer 2.1 oder der Zebrabärbling gemäß Abschnitt 5.1.5 einschläfern.
- Übertragen Sie die narkotisierter Zebrafisch auf den Deckel einer Petrischale. Ernten Sie mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge die Fin regenerieren. Stellen Sie sicher, stumpf Gewebe bei der Regeneration von Lamellen zur besseren Handhabung der geernteten Gewebe.
- Beheben Sie flossen flach in der PFA mit Petrischale bei 4 ° C über Nacht. Flache Fixierung vermeidet während der Fixierung des Gewebes Fin Eisstockschießen.
- Um flach zu beheben, greifen Sie die Fin-Gewebe mit einer feinen Pinzette am dorsalen und ventralen Rand des Stumpfes und Tauchen sie in die Fixierung-Lösung. Greifen Sie die gegenüberliegende Kante des Stumpfes mit einer zweiten feinen Pinzette und drücken Sie leicht das Gewebe an der Unterseite der Schale.
- Halten Sie für 10 bis 20 s vor der Freigabe. Das Fin-Gewebe sollte nicht mehr einrollen. Wenn dies der Fall, wiederholen Sie.
- Einschläfern Sie Zebrafisch um verletzten Schädel Gewebe zu ernten. Bereiten Sie einen Durchmesser von 100 mm Petrischale mit 0,1 % MS-222 in Fischwasser. Ein Zebrafisch gleichzeitig zum Übertragen der MS-222 enthaltende Petrischale mit einem Fischernetz Wenn 6 Anästhesie (medulläre Zusammenbruch) erreicht ist warten Sie mindestens 10 min um Tod der Probe12zu gewährleisten.
- Mit einem Skalpell schneiden Sie den Kopf plus ein wenig Kofferraum Gewebe vom Rest des Körpers. Tauchen Sie die geerntete Gewebe in die fertige 4 % PFA Lösung in Glas oder Kunststoff-Rohr. Fix für 24 h bei 4 ° C mit sanftes Schaukeln.
- Um Proben langfristig nach der Fixierung zu lagern, Waschen mit PBS (3 x 20 min bei RT) und Methanol-Genuss in einer zunehmenden Methanol-Serie (1 x 30 %, 1 x 50 %, 1 x 70 %, 2 x 100 % Methanol mit PBS-Puffer für jeweils 20 min.).
- Speichern sie in 100 % Methanol bei-20 ° C. Ansonsten fortfahren Sie direkt mit Knochen zu beflecken oder anderen Analysen nach dem Waschen mit PBS.
- Zur Fixierung von Flossen und/oder Schädel 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS vorbereiten und Einfrieren bei-20 ° C für die Lagerung. Verwendung frisch zubereitete 4 % PFA in PBS oder Tauwetter die erforderliche Menge vor dem Gebrauch. Alternativ 2 % PFA mit PBS-Puffer verwendet werden.
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Knochen Färbetechniken ich (Alizarin rote Färbung)
Hinweis: Diese Färbung erfolgt nach van Eeden Et Al. 199617 und Walker & Kimmel 200718 mit Modifikationen.- Zum Ausführen der Alizarin rote Flecken auf Erwachsene flossen oder Schädel ernten Sie und beheben Sie Gewebe zu, wie in den Abschnitten 5.1 beschrieben.
- Wenn Proben in Methanol bei-20 ° C gelagert wurden, rehydrieren Sie Proben auf diese Weise eine inverse Methanol-Serie (70 %, 50 % und 30 % in PBS, je 1 x 20 min.) und waschen Sie zweimal 20 min mit PBS. Beispiele für 5 min minimum mit entionisiertem Wasser zu waschen.
- Zu tun, Alizarin rote Färbung in Schädel, Proben mit 50 mg/mL Trypsin zu behandeln, in 30 % gesättigt Na2B4O7 bei Raumtemperatur über Nacht. Gesteinsproben während dieser Zeit. Spülen-Proben in 30 % gesättigt Na2B4O7 Lösung. Waschen Sie Proben mit entionisiertem Wasser 2 Mal für 5 min. Dieser Schritt ist nicht für Fin Gewebe ausgeführt.
- Alizarin rote Lösung (Teil B: 0,5 % rote Alizarin S Pulver, 10 % Glycerin in entionisiertem Wasser) hinzufügen und rock die Proben während der Inkubation bei RT-Check für Färbung nach 1, 2, 4 h oder über Nacht.
- Klar Proben mit einer abnehmenden 1 % Kalium Hydroxid: Glycerin-Reihe (3:1 Übernachtung, 1:1 Übernachtung, 1:3 Übernachtungen) behandeln.
- Speichern Sie die Proben in einer 1:1 Lösung von 0,1 % Kaliumhydroxid: 80 % Glycerin aus und Klebe sie mit 80 % Glycerin für die Bildgebung.
Hinweis: Für kombiniert Alcian blau/Alizarin rote Flecken behandeln Proben mit Alcian blau Färbelösung (Teil A: letzte 0,02 % Alcian blau, 50 mM MgCl2, 70 % Ethanol) nach Rehydratation (Abschnitt 5.2.2) für 2 h bei RT Treat flossen mit einer abnehmenden Ethanol-Reihe in 50 mM MgCl2 (70 %, 50 %, 30 %, jeweils 1 x 15 min) und waschen entionisiertem sie für ein Minimum von 1h (3 x 20 min) in Wasser. Fahren Sie fort mit Alizarin roten Färbung (Abschnitt 5.2).
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Knochen Färbetechniken II (Calcein Färbung)
Hinweis: Um Kalzium Ablagerung in Fin Frakturen und Schädel Verletzungen zu erkennen, sind lebende Fische in Calcein mit Lösung inkubiert.- Bereiten Sie die erforderliche Menge von 0,2 % Calcein in entionisiertem Wasser (pH 7,5). Stellen Sie sicher, dass der pH neutral ist. Verwenden Sie 1 M NaOH zur Einstellung des pH-Wertes.
- Inkubieren Sie bis zu 3 Zebrafisch gleichzeitig in 100 mL Calcein Lösung für 20 min in ein Becherglas mit Aluminiumfolie abgedeckt.
- Übertragen Sie der Zebrabärbling auf einen Becher mit Wasser. Lassen Sie sie kurz vor der Übertragung auf einen neuen Becher mit Fischwasser schwimmen. Lassen sie in diesem neuen Becher für 20 min waschen schwimmen. Fotografieren Sie (siehe Abschnitt 5.4).
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Live-imaging Zebrafisch
- Verwenden Sie diesen Ansatz, um Bilder Knochengewebe wie z. B. in der Flosse oder Schädel während des Experiments zu regenerieren, ohne Einbußen bei der Zebrabärbling zu erwerben. Betäuben Sie der Zebrabärbling gemäß Ziffer 2.1.
- Bilder von Fin regeneriert erwerben, übertragen Sie die narkotisierter Zebrafisch auf einer Petrischale Agarose-beschichtet (siehe Abschnitt 2.2.1 und Abbildung 1 b).
- Bilder der Schädelknochen Regeneration zu erwerben, stellen Sie der Zebrabärbling aufrecht in einem Schwamm (Abbildung 1) oder legen Sie sie in eine Agarose-beschichtete Gericht, die vorbereitet wurde, um den Stamm der Zebrafisch zu halten.
- Abrufen von Bildern auf die gewünschte Vergrößerung und Auflösung mit einem stereomicroscopic Setup.
- Der Zebrabärbling zu einem Behälter mit frischem oder Medikament mit Fischwasser zurück.
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Representative Results
Die hier vorgestellten Protokoll hat mehrfach induzieren schnelle Knochenbildung im Zuge der Erneuerung der Zebrafisch Fin und Schädel10,11,16eingesetzt. In Kombination mit der vorgestellten Methode von Prednisolon Verwaltung können Studien zu Prednisolon die Auswirkungen während der Knochenregeneration verfolgt werden. Zum Beispiel können Untersuchungen zur Knochenbildung und Mineralisierung in der Regeneration durchgeführt werden. Prednisolon, führt als andere Glukokortikoide19,20, zur allgemeinen Hemmung der Fin Regeneration, Knochenbildung, einschließlich von Alizarin rote Flecken auf feste Schwanzflosse Gewebe (Abbildung 3A) erkannt. In ähnlicher Weise hat Prednisolon aufschiebende Wirkung auf (calvarial) Schädel Verletzungen Verschluss, der durch Alizarin rot (Abb. 3 b) oder in Vivo Calcein Färbung dargestellt werden kann. Darüber hinaus übt Prednisolon eine tief greifende entzündungshemmende Wirkung im Fin und Schädel Gewebe durch Auslösung von Apoptose in der Monocyte/Makrophagen-Linie. Reduzierte Makrophagen Zahlen von Immunohistochemistry auf gefrorenes Gewebe detektiert werden Abschnitte, z. B. durch die Verwendung eines Antikörpers Anti-Mcherry in transgenen mpeg1: mCherry Zebrafisch (Abbildung 3)10,21 . Ebenso kann die Anzahl, Verteilung, Proliferation und Apoptose von anderen Zelltypen von Interesse sowohl in der Exo- und das Endoskelett (z.B. Wirbel) mit Hilfe von Immunohistochemistry analysiert werden.
Abbildung 1 : Verfahren durchgeführt im Zebrafisch. (A) Resektion der Schwanzflosse (Amputation) in narkotisierter Zebrafisch mit Hilfe eines Skalpells. Die rote gestrichelte Linie gibt die Amputation. (B) Fin ray Fraktur im narkotisierter Zebrafisch mit einer Injektionsnadel unter dem Stereomikroskop durchgeführt. Den Fisch legt während des Verfahrens auf eine Petrischale Agarose-beschichtet. Agarose-beschichteten Petrischalen werden auch verwendet, um Bilder der Zebrafisch flossen während der Regeneration oder Bruch Reparatur zu erwerben. (C) Trepanation Calvariae (Schädel Verletzungen) in Anaestetized Zebrafisch mit Hilfe von einem Microdrill unter dem Stereomikroskop durchgeführt. (D) Bild Erwerb Schädelknochen nach Verletzungen zu regenerieren. Die narkotisierter Zebrafisch liegt aufrecht in einem Schwamm und Bilder werden mit Hilfe eines Stereomikroskops erworben. Die Petrischale ist gefüllt mit Fischwasser mit 0,02 % MS-222. (E) Inkubation der Zebrafisch Prednisolon oder DMSO mit Fischwasser. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Mikroskopische live-Ansicht von Verletzungen bei 0 h Post Verletzungen Hpi). (A) Schwanzflosse Amputierte. Maßstabsleiste = 200 µm. (B) Fractured Fin Ray. Der Bruch wird durch den roten Pfeil angezeigt. Maßstabsleiste = 100 µm. (C) trepanierte Schädel. Die Verletzung Aufstellungsort wird durch die weiße Pfeilspitze angezeigt. Maßstabsleiste = 500 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Repräsentative Ergebnisse der Prednisolon-Behandlung bei Erwachsenen Zebrafisch. (A) Alizarin, die rot gefärbten Fin bei 14 Tagen Post Amputation (Dpa) und Tage der Behandlung (dt) regeneriert. Prednisolon behandelten Fin regeneriert sind kürzer (nicht dargestellt) und ein kleiner Bereich der Alizarin Rot positive Knochenmatrix erkannt wird. Maßstabsleiste = 500 µm. (B) Alizarin rot gebeizt Schädel auf 7 Tage Post Verletzungen (dpi) und die Deutsche Telekom. Maßstabsleiste = 100 µm. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis10geändert. (C) Cryosection angesichts der unverletzten Schädel und Gehirn-Gewebe (Prednisolon) behandelten und unbehandelten (DMSO) Tg (mpeg1: mCherry) x Tg (Osterix: nGFP) transgenen Reporter Fisch, in dem Makrophagen (angeborenen immunen Zellen) sind rot gekennzeichnet 21 und Knochen bilden Osteoblasten sind in grün22gekennzeichnet. Die Anzahl der Makrophagen sinkt deutlich im Zebrafisch Prednisolon behandelt. Immunohistochemistry erfolgte wie in Geurtzen Et Al. beschrieben 10. Kerne sind in blau (DAPI) beschriftet. Maßstabsleiste = 20 µm. BF: Hellfeld, Epid: Epidermis, Bn: Knochen. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis10geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Zebrafisch haben sich bewährt im Skelett Forschung in vielerlei Hinsicht. Ausgewählten Mutanten imitieren Aspekte menschlicher Erkrankungen wie Osteogenesis Imperfecta oder Arthrose23,24,25,26,27, und Larven sowie Skalen werden verwendet, um Identifizieren Sie Knochen anabole Verbindungen in kleinen Molekül Bildschirme7,28,29. Behandlungen von Zebrafisch mit Medikamenten, die in der klinischen Praxis angewendet werden eignen sich zudem ideal um vermeintliche Nebenwirkungen, zum Beispiel im Knochengewebe zu studieren. In diesem Zusammenhang ist das Vorhandensein von schnell regenerierenden Knochen vorteilhaft sein, die zugrunde liegenden Mechanismen des Medikamenten-induzierten Knochen Mängel zu untersuchen. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll in der medikamentösen Behandlung mit Glucocorticoid Prednisolon, eine häufig verwendete entzündungshemmende Medikament mit Nebenwirkungen im Knochengewebe, mit Erwachsenen Bone Regeneration Regimen kombiniert ist. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um induzieren immunsuppressive und Knochen hemmende Effekte in regenerative Gewebe des Zebrafisch und kann auch für Studien über die Auswirkungen von Prednisolon und anderen Drogen in Erwachsenen Gewebe wie der Wirbelsäule angepasst werden. Folgenden Angaben sollten berücksichtigt werden, wenn immunsuppressive medikamentöse Behandlungen im Zebrafisch durchmachenden Fin oder Schädel Regeneration durchgeführt werden.
Reproduzierbarkeit der Verletzung assays
Während der Regeneration Fin hängt Regeneration Geschwindigkeit (d. h. Regrowth von Fin Gewebe, einschließlich Knochen pro Zeiteinheit) sehr stark von den Betrag von Fin-Gewebe, das resezierten13wird. Um unerwünschte Variabilität der Fin Regeneration zu vermeiden, stellen Sie sicher, immer äquivalenzbeträge Fin Gewebe in allen Proben resezieren.
Ausführung von knöchernen Fin Ray Frakturen erfolgt durch leicht drücken eine Injektionsnadel in die Mitte eines gewählten knöchernen Fin Ray-Segments. Wie knöcherne Fin Strahlen aus 2 gegnerischen Hemirays bestehen, bestimmt die Höhe der Druck verwendet, ob nur eine oder beide Hemirays gebrochen sind. Wir bevorzugen Niederdruck zum Bruch nur eine Hemiray anzuwenden, da Bruch der beiden Hemirays tendenziell die Fin Ray zu destabilisieren, die infolgedessen während der folgenden Tage lösen kann.
Calvarial Verletzungen des Schädels von Mikrobohrungen sollten vorsichtig ausgeführt werden. Wenn Schaden, das Gehirn (d. h. das Kleinhirn) Haltungs- und Bewegungsorganen zugefügt wird werden Defizite durch fehlerhaftes Schwimmen der Probe15sichtbar. Zebrafisch mit zerebelläre Schädigung Nebenwirkungen der medikamentösen Behandlung zeigen kann und sollte nicht verwendet werden, um die Knochenregeneration zu studieren.
Überlegungen in Bezug auf medikamentöse Behandlungen
Um eine konsequente immunsuppressive und Anti-regenerative Wirkung im Erwachsenen Zebrafisch beschäftigen wir eine Dosis von 50 µM Prednisolon in Fischwasser. Wir identifiziert diese Dosis während der ersten Dosis-Wirkungs-Experimente in Larven und Erwachsenen Zebrafisch. Daher sollten Dosis-Wirkungs-Experimente, um die erforderliche Dosis von Andere immunsuppressive Wirkstoffe zu identifizieren, die angewendet werden können durchgeführt werden. Für Erwachsene empfehlen wir kombinieren diese erste Experimente mit dem Fin-Regeneration-Regime, da Fin regenerieren Länge einer hochsensiblen und leicht zu erkennende Anzeige für Gewebeveränderung.
Immunsuppressive Behandlung prädisponiert behandelten Proben mikrobielle Infektionen. Gehäuse in Autoklaven Becher mit autoklaviert Fischwasser sind deshalb wichtig. Obwohl diese Bedingungen mehr umständlich durchzuführen sind und nicht steril, helfen sie, um Infektion im behandelten Zebrafisch zu minimieren. Wir nicht Vorbehandeln ("sterilisieren") Artemia Eier. Jedoch könnte dies eine zusätzliche Maßnahme zur Vorbeugung von Infektionen im Zebrafisch, ggf. sein. Darüber hinaus können antiseptische Substanzen wie Methylenblau (1 %), um Wasser vor dem Gebrauch zu Fischen hinzugefügt werden.
Experimente mit Prednisolon, sowohl kurz-als auch langfristige, erfordern tägliche Änderungen der Fischwasser. Wir haben Erwachsene Zebrafisch für bis zu 8 Wochen behandelt. Behandlung einer großen Anzahl von Personen für eine lange Zeit kann zu einer bestimmten experimentellen "Last" führen und sollte sorgfältig geplant werden. Es ist von zentraler Bedeutung, haben immer die benötigten Mengen an autoklaviert Fisch Wasser und Glas Geschirr bereit. Obwohl dies nicht im Zebrafisch (nach unserem Kenntnisstand) getestet wurde, kann Implantation von slow-Release-Pellets für Drogen von Interesse eine wertvolle Alternative für langfristige Arzneimittelexposition im Zebrafisch darstellen.
Analysen in transgenen Zebrafisch
Hier präsentieren wir Ihnen 2 Methoden, für die Mineralisierung/Verkalkung der Knochengewebe von Alizarin rot und Calcein Färbung zu beflecken. Darüber hinaus zeigen wir, wie zu regenerierenden Fin und Schädel Gewebe in Vivo mit Hilfe eines Stereomikroskops Bild. Diese Technik ist sehr nützlich, wenn transgene Zebrafisch Berichterstattung die Nummer oder die Aktivität der ausgewählten Zellen, z. B. Osteoblasten oder Immunzellen, abgebildet sein werden. Zum Beispiel vor Opfern verletzt und Prednisolon behandelt Zebrafisch durchführen, Alizarin rote Färbung, Fin regeneriert oder trepanierte Schädel Reparatur unterziehen können fotografiert werden, um die Präsenz, Anzahl und Aktivität der Knochen bilden Osteoblasten in suchen Die transgenen Reporter Linie Tg (Osterix: nGFP)22. Ebenso kann epidermale Wundverschluss, die innerhalb eines Tages auftritt, in transgene Fische, die ein Fluorophor in epidermalen Gewebe Ausdrücken visualisiert werden. Ansammlung von Immunzellen an der Stelle der Verletzung (oder deren Abwesenheit bei Prednisolon behandelt Personen) kann auch leicht mit einem Stereomikroskop mit den erforderlichen Lichtquelle und Filter ausgestattet überwacht werden.
In der Summe kann das Protokoll hier vorgestellten zur Studie über Auswirkungen von immunsuppressiven Agenten und anderen Drogen nach systemischen Verabreichung im Zebrafisch, die Knochenregeneration im Fin oder Schädel durchmachen. Dies wird nützlich, die Pathogenese der GIO abzugrenzen und die Mechanismen, die erfolgreiche Knochenregeneration zu untersuchen sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von Zentrum für Regenerative Therapien Dresden ("Zebrafisch als Vorbild, die Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Knochenabbau zu entwirren") und zusätzlich durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, Projekt 387653785) FK. Wir sind sehr dankbar, Jan Kaslin und Avinash Chekuru für ihre Beratung und Unterstützung zur Durchführung Trepanation von Calvariae und Frakturen in knöchernen Fin Strahlen. Experimente wurden so konzipiert, durchgeführt und analysiert durch KG und FK. FK schrieb das Manuskript. Wir möchten auch danke Katrin Lambert, Nicole Cudak und anderen Mitgliedern von den Knopf und Marke Labs für technische Hilfe und Diskussion. Unser Dank gilt auch Marika Fischer und Jitka Michling für ausgezeichneten Fisch Pflege und Henriette Knopf und Josh Currie für das Korrekturlesen der Handschrift.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prednisolone | Sigma-Aldrich | P6004 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Blunt forceps | Aesculap | BD027R | |
| Fine forceps | Dumont | 91150-20 | |
| Scalpel | Braun | 5518059 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Injection needle (0.3 mm x 13 mm) | BD Beckton Dickinson | 30400 | |
| Micro drill | Cell Point Scientific | 67-1000 | distributed e.g. by Harvard Apparatus |
| Steel burrs (0.5 µm diameter) | Fine Science tools | 19007-05 | |
| Artemia ssp. | Sanders | 425GR | |
| Pasteur pipette (plastic, Pastette) | Alpha Labs | LW4111 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Alizarin red S powder | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alcian blue 8 GX | Sigma-Aldrich | A5268 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16 FA | with QIMAGING RETIGA-SRV camera |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 | with Olympus DP71 or DP80 camera |
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