cd4+ t 细胞的分离及6色流式细胞仪分析外周血中循环 t-滤泡 (ctfh) 细胞亚群

Elliot Byford; Matthew Carr; Lucia Piñon; Matthew J. Ahearne; Simon D. Wagner

doi:10.3791/58431

Method Article

cd4⁺ t 细胞的分离及6色流式细胞仪分析外周血中循环 t-滤泡 (ctfh) 细胞亚群

DOI:

10.3791/58431

⸱

January 7th, 2019

Elliot Byford¹ , Matthew Carr¹ , Lucia Piñon² , Matthew J. Ahearne¹ , Simon D. Wagner¹

¹Leicester Cancer Research Centre and Ernest and Helen Scott Haematology Research Institute, University of Leicester, ²MRC Toxicology Unit, University of Leicester

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种从人外周血中分离和表征 cd4 + t 细胞亚群的方法。采用流式细胞仪对纯化的 cd4⁺ t 细胞进行分析, 以确定 t-滤泡辅助细胞亚群的比例。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在自身免疫性条件下检测到 t-滤泡辅助细胞 (tfh) 细胞活性, 当分析 b 细胞非霍奇金淋巴瘤的淋巴结微环境时, 它们的存在与临床结果有关。循环 t-滤泡辅助细胞 (ctfh) 的子集, 血液中 tfh 细胞的循环记忆室, 也在疾病中受到干扰, 因此代表了潜在的新的预测生物标志物。周边血样检测是有利的, 因为它是相对非侵入性的, 并允许简单的串行监测。本文介绍了一种从人的血液中分离 cd4⁺ t 细胞的方法, 并通过流式细胞仪进一步分析, 以列举 ctfh 细胞及其各种子集的比例 (ctfphd-1-^/+/,ctfh1, 1, 17 和 ctfh一个半小时)。然后比较正常受试者和淋巴瘤患者之间这些亚群的水平。我们发现, 这种方法足够稳健, 可以从例行采集的病人材料中获得可靠的结果。我们描述的分析技术可以很容易地适应细胞分类和下游应用, 如 rt-pcr。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

t 型滤泡辅助细胞 (tfh) 是 cd4⁺ t 细胞亚群, 最初的特征是在淋巴组织¹中。这些细胞表达 pd-1 和 cxcr5 表面受体, 分泌 il-21 和 il-4, 并显示转录因子 bcl-6^2,3 的核表达。顾名思义, 它们存在于萌发中心, 对于高亲和力抗体的产生是必不可少的.

失调的 tfh 反应与疾病发病机制有关, 最显著的是自身免疫性疾病, 它们促进自反应 b 细胞⁴的扩张。它们还在固体⁵^、^{6 和}淋巴癌7的肿瘤微环境中发挥作用。相反, 表面蛋白的遗传缺陷是 tfh 功能所必需的, 如诱导 t 细胞共计器 (icos) 会导致人体免疫缺陷综合征8。人类外周血中的 cd4 + cTfh⁺细胞被称为循环 t 型滤泡辅助细胞 (ctfh), 被认为是^{组织 9}中 tfh 细胞的记忆室。本文....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

从正常人 (ns) (n = 12) 以及边缘区淋巴瘤 (mzl) (n = 7) 和其他类型的 b 细胞非霍奇金淋巴瘤 (bnhl) (6 例 fl 患者、2例淋巴浆细胞淋巴瘤患者和1个低品位 b 细胞) 中提取血液样本非霍奇金淋巴瘤没有其他指定的病人)。在给予知情、书面同意并对所有研究进行道德认可的情况下, 从莱斯特皇家医务室的血液诊所招募了患者。莱斯特郡、北安普敦郡和鲁特兰研究伦理委员会1获得了道德批准, 病人样本的参考是 0q250. i 122, 卫生研究局 (hra) 委员会东 midlands-devce, 参考14/em/176正常科目。

1. 从全外周血中分离 cd4⁺ t 细胞

通过标准静脉穿刺和工艺, 尽快将新鲜外周血(2 至15毫升) 放入 k2 edta 管中, 以保持最大的活力。
请注意:使用标准的实验室个人防护设备 (外套、手套、眼镜), 并在二级生物安全柜中开展工作。
将血液和所有必要的试剂 (cd4⁺浓缩鸡尾酒、2% 的胎牛血清磷酸盐缓冲盐水 (fbsbsp)、密度梯度培养基和冷冻介质 (如果冷冻保存细胞) 带到室温。
将血液与市售的抗体混合物混合, 以丰富人类 cd4⁺ t 细胞。每1毫升血液使用50μl 试剂。使用50毫升锥形聚丙烯管5至15毫升的血液。....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cd4⁺隔离协议可实现高 cd4⁺纯度, 在我们检测的所有血液样本中都是可靠的 (均为: 966%, sd:2.38, ncos31) (图 3)。

给出了具有代表性的法题 ctfh (cd4⁺ cTfh⁺细胞) 的识别方法 (图 4a)。cd4⁺细胞中 ctfh 细胞的平均值为 29.4% (四分位间范围 (iqr) = 10.8), 在12个正常人中。多项不同疾病的研究, 包括肝细胞癌^17,²⁰, 系统性红斑狼疮¹¹^.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议是一种分析外周血 ctfh 细胞的简单而有效的方法, 能够检测到迄今为止文献中确定的所有相关子集。血液样本可以很容易和有效地获得作为标准门诊诊所的一部分, 和系列样本可以收集平行的临床数据。反过来, 这使得前瞻性研究能够评估 ctfh 亚群作为疾病进展或治疗反应的生物标志物。这些研究将特别需要在疾病中, 其中 tfh 失调与发病机制有关, 如自身免疫和某些类型的固体和血液病癌症。此外, 本方案仅使用细胞表面标记, 通过流式细胞术对 ctfh 细胞进行分选, 可以研究疾病中 ctfh 功能的变化。对 mzl 患者的 ctfh 细胞进行排序, 使我们能够发现与正常受试者²¹相比, 基因表达谱存在差异。

我们发现, 有效的 cd4⁺ t 细胞分离改善了数据分析。我们详细介绍了所涉及的步骤, 因为离心机制动和速度等小问题对隔离过程至关重要。另一个重要步骤, 所有流式细胞术分析, 是设置补偿和 fmo 控制。

pd-1 在 ctfh 细胞上的表达各不相同, pd.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了英国白血病公司向 e t b 和 mja 提供的赠款的支持。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
RosetteSep 人 CD4+ T 细胞富集混合物	STEMCELL TECHNOLOGIES	15062
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Life Sciences	17144003
BUV395 小鼠抗人 CD183 克隆 1C6/CXCR3	BD Horizon	565223
BV711 小鼠抗人 CD196 （CCR6）克隆 11A9	BD Horizon	563923
BV421 大鼠抗人 CXCR5 （CD185）克隆 RF8B2	BD Horizon	562747
BB515 小鼠抗人 CD4 克隆 RPA-T4	BD Horizon	564419
PE 小鼠抗人 CD279 克隆 MIH4	BD 药	557946
APC-H7 小鼠抗人 CD45RA 克隆 HI100	BD 药剂560674
LIVE/DEAD 可固定远红死细胞染色试剂盒，用于 633 或 635 nm 激发	ThermoFisher Scientific	L34973
Brilliant 染色缓冲液	BD Horizon	563794
抗小鼠 Ig，κ/阴性对照补偿颗粒套装	BD CompBead	552843
FACS Aria II 流式细胞仪	BD
			流式细胞仪采集软件
FlowJo 10.2	Treestar Inc.		流式细胞术数据分析软件
抗 CXCR3 抗体	BD Horizon
抗CCR6抗体	BD Horizon
抗 CXCR5 抗体	BD Horizon
抗 CD4 抗体	BD Horizon
抗 PD-1 抗体	BD Pharmingen
抗 CD45RA 抗体	BD Pharmingen
活力标记物	ThermoFisher Scientific	编号 L34973

学 FACSDiva 6.1.3 BD Biosciences 644832 643629 565223563923562747564419557946560674

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. Follicular Helper T Cells. Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).
Nurieva, R. I., et al. Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells. Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

cd4⁺ t 细胞的分离及6色流式细胞仪分析外周血中循环 t-滤泡 (ctfh) 细胞亚群

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles