MALT1 regelt die angeborene Immunität, aber wie in diesem Fall bleibt unklar. Wir verwendet die selektive MALT1 Paracaspase Inhibitor MLT-827 um zu entwirren den Beitrag von MALT1 zur angeborenen Signalisierung von Toll-Like oder C-Art Lectin-Like-Rezeptoren, zeigen, dass MALT1 die Produktion der myeloischen Zytokine reguliert, vor- und nachgelagerten der C-Art Lectin-Like-Rezeptoren selektiv.
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Methodenartikel
Myeloische angeborene Signalisierung Pathway Verordnung von MALT1 Paracaspase Tätigkeit
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neben seiner Funktion in lymphoiden Zellen, die durch zahlreiche Studien behandelt wurden, Rolle die Paracaspase MALT1 auch eine wichtige in angeborene Zellen unterhalb der Muster-Erkennung-Rezeptoren. Am besten untersucht sind die Dectin-1 und Dectin-2 Mitglieder der C-Typ-Lektin-Like-Rezeptor-Familie, die eine SYK - und CARD9-abhängige Signalkaskade zu NF-κB Aktivierung in einem MALT1-abhängigen Weise zu induzieren. Propagieren Sie durch Kontrast, Toll-Like-Rezeptoren (TLR), z. B. TLR-4 NF-κB Aktivierung aber Signal über eine Kaskade von MYD88/IRAK-abhängige. Dennoch, ob MALT1 TLR-4 Signalisierung beitragen kann ist unklar geblieben. Den letzten deutet mit MLT-827, ein potenter und selektiver Inhibitor von MALT1 Paracaspase Aktivität, darauf hin, dass TNF-Produktion flussabwärts von TLR-4 in menschlichen myeloische Zellen unabhängig von MALT1, im Gegensatz zu TNF-Produktion flussabwärts von Dectin-1, das ist MALT1 angewiesen. Hier haben wir die selektive Einbeziehung von MALT1 in Mustererkennung Fernerkundung weiter, unter Verwendung einer Vielzahl von Mensch und Maus zellulären Präparate und Stimulation der Dectin-1, MINCLE oder TLR-4 Bahnen. Wir lieferten auch zusätzliche Erkenntnisse durch die Zytokine TNF-Erforschung und durch den Vergleich von MLT-827 ein SYK-Inhibitor (Cpd11) und ein IKK-Inhibitor (AFN700). Gemeinsam zur Verfügung gestellten Daten weitere Beweise für die MALT1-Abhängigkeit der C-Art Lectin-Like Rezeptor-Signalisierung im Gegensatz zu TLR-Signalisierung.
Einleitung
Die Paracaspase Aktivität von MALT1 (Mucosa-assoziierte Lymphgewebe Lymphom Translokation Protein 1) zeigte sich in 20081,2. Seit dieser Zeit haben eine Reihe von Studien ihren kritischen Beitrag zur Antigen-Rezeptor-Antworten in Lymphozyten berichtet. Genetische Modelle in der Maus sowie Pharmakologie Daten eine wichtige Rolle in T-Zellen, T-Zell-abhängigen Autoimmunität und B-Zell-Lymphom Einstellungen3,4unterstützen. In Lymphozyten, MALT1 Paracaspase Ansteuerung erfolgt bei der Montage eines CARD11-BCL10-MALT1 Komplex5, ausge....
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Protokoll
Gemäß den Richtlinien und Normen der menschlichen Ethik-Forschungskommission Novartis wurden Experimente durchgeführt.
1. Vorbereitung des peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von menschlichen Buffy Coats
Hinweis: Wir erhielten buffy Coats von gesunden Probanden einen Tag nach der Entnahme in 50 mL Beuteln. Sie waren Einverständniserklärung zur Verfügung gestellt und durch das Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuzgesammelt. Wir behandelt sie mit dem Verfahren unter, bei Raumtemperatur, wenn nicht anders angegeben.
- Bereiten Sie ein steril und sauber Paar Sc....
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Ergebnisse
In myeloische Zellen Relais MALT1 Aktivierung Signale unterhalb der mehrere C-Art Lectin-Like-Rezeptoren, wie z. B. Dectin-1, Dectin-2 und MINCLE6. Diese Wege verlassen sich auf (Saum) ITAM Motiv-haltigen Rezeptoren (z. B., Dectin-1) oder ITAM Motiv-haltigen Co-Rezeptoren (z. B., FcRγ für Dectin-2 und MINCLE), das rekrutieren und aktivieren die Kinase SYK (Abbildung 1). Dies führt zu einer Aktivierung von einem Protei.......
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Diskussion
In dieser Arbeit verwendeten wir einfache experimentelle Einstellungen um Signalwege in der Human- und angeborene Mauszellen zu studieren und ihre Abhängigkeit von MALT1 proteolytischen Funktion zu verhören. Aufbauend auf früheren Arbeiten11, zeigte unsere Studie, dass MALT1 Paracaspase Aktivität C-Type Lektin-ähnlichen Rezeptoren induzierte Produktion von Zytokinen, einschließlich TNF-α steuert. Im Gegensatz dazu war TLR-4-induzierte TNF-α unabhängig von MALT1 in beiden Arten. Kollektiv, bestätig.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken für ihre Berechtigung (Lizenz-Nummer 4334770630127), hier zu reproduzieren Figur 2A von Unterreiner Et Al. Elsevier (2017).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100 &Mikro; m Nylon-Zellsieb | Sigma | CLS431752 | |
| 14 mL Falcon Röhrchen | BD Falcon | 352057 | |
| 15 mL Falcon Röhrchen | Falcon | 352090 | |
| 50 mL Falcon Röhrchen | Falcon | 352070 | |
| 6 Well-Platten | Costar | 3516 | |
| 96 Well-Platte mit flachem Boden, mit Deckel mit geringer Verdampfung | Costar | 3595 | |
| 96 Well V-Bodenplatte | Costar | 734-1798 | |
| Ammoniumchlorid - NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Assay Verdünnungsmittel RD1-W ELISA | R& D | 895038 | Assay Verdünnungsmittel |
| Zellkultur-Mikrotiterplatte, 384 Well, schwarz | Greiner | 781986 | |
| Depleted Zymosan | Invivogen | tlrl-dzn | jetzt: tlrl-zyd |
| Dimethylsulfoxid | Sigma | D2650 | DMSO |
| EDTA-Na2 | Sigma | E5134 | Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalzdihydrat |
| ELISA muTNF-α | Forschung & Forschung D | SMTA00 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| gentleMACS C Röhrchen | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Dissoziator | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| GM-CSF | Novartis-Hitzeinaktiviertes | ||
| fötales Rinderserum | Gibco | 10082 | FBS |
| HTRF hu IL-23 | CisBio | 62HIL23PEG | |
| HTRF hu TNF-α | CisBio | 62TNFPEC | |
| HTRF Rekonstitutionspuffer | CisBio | 62RB3RDE | 50mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2% BSA |
| IFN-& gamma; | Forschung & Forschung D | L4516 | |
| IL-4 | Novartis-Isofluran | ||
| Abbott | Forene | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | LPS zur Verwendung in menschlichen |
| Proben Lipopolysaccharide | Sigma | L4516 | LPS zur Verwendung in murinen Proben |
| Lysepuffer | Selbstgemacht-155 | mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4 | |
| Magnet | Stemcell | 18001 | |
| Mikrotiterplatte, 384 Well, weiß | Greiner | 784075 | |
| Monozyten Anreicherungskit | Stemcell | 19059 | |
| Nalgene Mr. Frosty Cryo 1° C Gefrierbehälter | Nalgene | 5100-0001 | Kühlgerät (enthält Propanol-2) |
| PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2 [-] MgCl2 | Gibco | 10010 | Phosphatgepufferte Kochsalzlösung |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Pen/Strep |
| Kaliumbicarbonat - KHCO3 | Sigma | P9144 | |
| PrestoBlue | Invitrogen | A13262 | Resazurin-Lösung zur Viabilitätsbewertung |
| Propanol-2 | Merck | 1.09634 | |
| Lesepuffer | MesoScale Discovery | R92TC-3 | Tris-basierter Puffer mit Tripropylamin |
| Rückgewinnung Zellkultur-Einfriermedium | Gibco | 12648-010 | Einfriermedium |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) mit Glutamax | Gibco | 61870 | + 10% FBS für iMoDCs + 10% FBS + 1 mM Natriumpyruvat + 100 U/mL Pen/Strep + 5 µ M β-Mercaptoethanol für humane PBMC und Monozyten + 10% FBS + Pen/Strep + 5 µ M β-Mercaptoethanol für murine Splenozyten |
| Trennpuffer | Self-made-PBS | pH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0 | |
| Natriumpyruvat | Gibco | 11360 | |
| Trehalose-6,6-dibehenat | Invivogen | tlrl-tdb | TDB |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | Polysorbat 20 |
| UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0 | Invitrogen | 15675 | Ethylendiamintetraessigsäure |
| Viewseal Versiegelung | Greiner BioOne | 676070 | |
| V-PLEX Proinflammatorisches Panel 1 Human Kit | MesoScale Discovery | K15049D | Elektrochemilumineszenz-Multiplex-Assay (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8) |
| β-Mercaptoethanol | Gibco | 31350 |
Referenzen
- Coornaert, B., et al. T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20. Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).
- Rebeaud, F., et al. The pr....
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Nachdrucke und Genehmigungen
