Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto
Summary
L’obiettivo generale di questo articolo è quello di standardizzare il protocollo per l’isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache (CSCs) dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo di centrifugazione su gradiente di densità per isolare murino CSCs e metodi elaborati per la cultura, la proliferazione e la differenziazione in cardiomiociti di CSC.
Abstract
Infarto miocardico (MI) è delle cause principali di morbilità e mortalità nel mondo. Degli obiettivi principali della medicina rigenerativa è per ricostituire il miocardio morto dopo MI. Anche se diverse strategie sono state utilizzate per rigenerare il miocardio, terapia con cellule staminali rimane un approccio importante per ricostituire il miocardio morto di un cuore MI. Raccogliendo la prova suggerisce la presenza di cellule staminali residenti cardiache (CSCs) nel cuore adulto e loro effetti endocrini o paracrino sulla rigenerazione cardiaca. Tuttavia, CSC isolamento e loro caratterizzazione e differenziazione verso le cellule del miocardio, soprattutto cardiomiociti, rimane una sfida tecnica. Nello studio presente, abbiamo fornito un metodo semplice per l’isolamento, caratterizzazione e differenziamento di CSCs dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo del gradiente di densità per l’isolamento delle CSCs, dove il cuore è digerito da una soluzione di 0,2% collagenosi II. Per caratterizzare le CSCs isolate, abbiamo valutato l’espressione di marcatori di CSCs/cardiaco Sca-1, NKX2-5 e GATA4 e marcatori di pluripotenza/staminalità OCT4, SOX2 e Nanog. Inoltre abbiamo determinato il potenziale di proliferazione di CSCs isolato messa in coltura in una capsula di Petri e valutando l’espressione del marker di proliferazione Ki-67. Per valutare il potenziale di differenziazione delle CSCs, abbiamo selezionato sette – dieci – giorni coltivate CSCs. Li abbiamo trasferito in una nuova piastra con un mezzo di differenziazione dei cardiomiociti. Essi vengono incubati in un’incubatrice di coltura cellulare per 12 giorni, mentre il mezzo di differenziazione viene cambiato ogni tre giorni. Le CSCs differenziate esprimono marcatori del cardiomyocyte specifiche: actinina e troponina I. Così, CSCs isolato con questo protocollo dispone di staminalità e marcatori cardiaci, e hanno un potenziale di proliferazione e differenziazione verso cardiomyocyte lignaggio.
Introduction
Cardiopatia ischemica, tra cui l’infarto miocardico (MI), è delle principali cause di morte intorno al mondo1. Terapia con cellule staminali per la rigenerazione del miocardio morto rimane un approccio importante per migliorare la funzione cardiaca di un MI cuore2,3,4,5. Diversi tipi di cellule staminali sono stati utilizzati per ricostituire il miocardio morto e migliorare la funzione cardiaca di un cuore MI. Essi possono essere categorizzati largamente in cellule staminali embrionali di6 e adulto di cellule staminali. In cellule staminali adulte, sono stati utilizzati vari tipi di cellule staminali, ad esempio cellule mononucleari derivate da midollo osseo7,8, cellule staminali mesenchimali derivate da midollo osseo9,10, tessuto adiposo 11,12e del cordone ombelicale13e CSCs14,15. Le cellule staminali possono promuovere rigenerazione cardiaca attraverso endocrine e/o paracrino azioni16,17,18,19,20. Tuttavia, una limitazione importante della terapia con cellule staminali è l’ottenimento di un adeguato numero di cellule staminali che possono proliferare e differenziarsi verso una specifica linea cardiaca21,22. Trapianto autologo e allogenico di cellule staminali è una sfida importante in cellule staminali terapia9. CSCs potrebbe essere un approccio migliore per la rigenerazione cardiaca perché sono derivati dal cuore e possono essere più facilmente differenziati in cardiaci lignaggi di cellule staminali non-cardiaca. Quindi, riduce il rischio di teratoma. Inoltre, gli effetti endocrino e paracrino delle CSCs, quali esosomi e Mirna derivati da CSCs, potrebbero essere più efficaci rispetto ad altri tipi di cellule staminali. Così, CSCs rimane un’opzione migliore per la rigenerazione cardiaca23,24.
Anche se CSC sono un candidato migliore per la rigenerazione cardiaca in un cuore MI dovuto la loro origine cardiaca, una limitazione importante con CSC è meno resa a causa della mancanza di un metodo efficiente isolamento. Un’altra limitazione potrebbe essere alterata differenziazione delle CSCs verso cardiomyocytes lineage2,25,26,27. Per ovviare a queste limitazioni, è importante sviluppare un efficiente protocollo per isolamento, caratterizzazione e differenziamento verso la linea cardiaca CSC. Non c’è nessun singolo indicatore accettabile per CSCs e un isolamento specifico di basati su marcatore cellula-superficie di CSCs produce meno CSCs. Qui, abbiamo standardizzare un approccio semplice centrifugazione su gradiente per isolare CSCs dal cuore del mouse che è conveniente e si traduce in un maggiore rendimento di CSCs. Questi CSCs isolato è selezionabile per specifici marcatori di superficie cellulare di corto circuito di fluorescenza-attivato delle cellule. Oltre all’isolamento di CSCs, abbiamo fornito un protocollo per cultura CSC, caratterizzazione e differenziamento verso cardiomyocyte lignaggio. Così, vi presentiamo un metodo elegante per isolare, caratterizzare, cultura e differenziare CSCs da cuori di topo adulto (Figura 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
I punti critici di questo protocollo di isolamento del CSC sono come segue. 1) una condizione sterilizzata deve essere mantenuta per l’estrazione dei cuori dai topi. Qualsiasi contaminazione durante l’estrazione del cuore può compromettere la qualità della CSC. 2) il sangue deve essere completamente rimosso prima di tritare il cuore, che è fatto da diversi lavaggi di tutto il cuore e il cuore a pezzi con soluzione HBSS. 3) i pezzi di cuore devono essere completamente lisati in sospensione unicellulare con soluzione de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato, in parti, dalle sovvenzioni National Institutes of Health HL-113281 e HL116205 a. punti Kumar Mishra.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
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