Isolering og karakterisering differensiering av Cardiac stamceller fra voksen mus hjertet
Summary
Det overordnede målet med denne artikkelen er å standardisere protokollen for isolasjon, karakterisering og differensiering av cardiac stamceller (CSCs) fra voksen mus hjertet. Her beskriver vi en tetthet gradert sentrifugering metode for å isolere murine CSCs og utdypet metoder for CSC kultur, spredning og differensiering inn cardiomyocytes.
Abstract
Myocardial infarction (MI) er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet verden. Et hovedmål for regenerativ medisin er å fylle døde myokard etter MI. Selv om flere strategier har blitt brukt til å regenerere myokard, fortsatt stilk cellen terapi en stor tilnærming til fylle døde myokard en MI hjerte. Samler bevis antyder tilstedeværelsen av bosatt cardiac stamceller (CSCs) i voksen hjertet og endokrine og/eller paracrine effekter på cardiac gjenfødelse. CSC isolering og karakterisering og differensiering mot hjerteinfarkt celler, spesielt cardiomyocytes, er imidlertid en teknisk utfordring. Studien gitt vi en enkel metode for isolasjon, karakterisering og differensiering av CSCs fra voksen mus hjertet. Her beskriver vi en tetthet gradert metode for isolering av CSCs, der hjertet er fordøyd av en 0,2% collagenase II løsning. Betegner de isolerte CSCs, vurdert vi uttrykk for CSCs/hjerte dataindikatorer Sca-1, NKX2-5 og GATA4 og pluripotency/stemness markører OCT4, SOX2 og Nanog. Vi har også bestemt spredning potensialet i isolerte CSCs dyrking dem i en Petriskål og vurdere uttrykk for spredning markøren Ki-67. For å vurdere differensiering potensialet i CSCs, valgte vi syv – til ti – dager kultivert CSCs. Vi overført dem til en ny plate med en cardiomyocyte differensiering medium. De er ruges i en celle kultur inkubator for 12 dager, mens differensiering mediet endres hver tredje dag. Differensiert CSCs express cardiomyocyte-spesifikke indikatorer: actinin og troponin jeg. Dermed CSCs isolert med denne protokollen har stemness og kardiale markører, og de har et potensial for spredning og differensiering mot cardiomyocyte avstamning.
Introduction
Iskemisk hjertesykdom, inkludert hjerteinfarkt (MI), er en viktig dødsårsak rundt verden1. Stilk cellen terapi for regenererende døde myokard er fortsatt en stor tilnærming forbedre hjerte funksjonen av en MI hjertet2,3,4,5. Ulike typer stamceller har brukt å fylle døde myokard og forbedre hjerte funksjon av en MI hjerte. De kan grovt deles inn embryonale stamceller6 og voksne stamceller. I voksen stilk celler brukt ulike typer stamceller som Ben margtransplantasjon-avledet mononukleære celler7,8, mesenchymal stamceller hentet fra benmargen9,10, fettvev 11,12, og navlestreng13og CSCs14,15. Stamceller kan fremme cardiac gjenfødelse endokrine og/eller paracrine handlinger16,17,18,19,20. Imidlertid er en stor begrensning av stilk cellen terapi å skaffe et tilstrekkelig antall stamceller som kan spre og/eller skille mot et bestemt hjerte avstamning21,22. Autologous og allogenic transplantasjon av stamceller er en viktig utfordring i stamcelleforskningen terapi9. CSCs kan være en bedre tilnærming for cardiac regenerering fordi de er utledet fra hjertet, og de kan være mer lett atskilt i cardiac overleveringslinjer enn ikke-hjerte stamceller. Dermed reduseres risikoen for teratoma. I tillegg kan endokrine og paracrine effekten av CSCs, som exosomes og miRNAs fra CSCs, være mer effektivt enn andre typer stamceller. Dermed CSCs fortsatt et bedre alternativ for cardiac gjenfødelse23,24.
Selv om CSCs er en bedre kandidat for cardiac gjenfødelse en MI hjerte på grunn av deres hjerte opprinnelse, er en stor begrensning med CSCs mindre avkastning på grunn av mangel på en effektiv isolasjon metode. En annen begrensning kan være svekket differensiering av CSCs mot cardiomyocytes, avstamning,2,,25,,26,,27. For å omgå disse begrensningene, er det viktig å utvikle en effektiv protokoll for CSC isolasjon, karakterisering, og differensiering mot cardiac avstamning. Det er ingen enkelt akseptabel markør for CSCs og en bestemt celle-overflate markør-baserte isolering av CSCs gir mindre CSCs. Her standardisere vi en enkel gradient sentrifugering tilnærming for å isolere CSCs fra musen hjertet som er kostnadseffektiv og resulterer i en økt avkastning på CSCs. Disse isolerte CSCs kan velges for bestemt celle-overflate markører ved fluorescens-aktivert celle shorting. I tillegg til CSCs isolasjon gitt vi en protokoll for CSC kultur, karakterisering, og differensiering mot cardiomyocyte avstamning. Derfor presenterer vi en elegant metode for å isolere, karakteriserer, kultur, og skille CSCs fra voksen mus hjerter (figur 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
De avgjørende skritt i denne CSC isolasjon protokollen er som følger: 1) sterilisert betingelse må opprettholdes for utvinning av hjerter fra mus. Enhver kontaminering under hjertet utvinning kan kompromittere kvaliteten av CSCs. 2) blod må fjernes fullstendig før hakking hjertet som er gjort av flere vasker hele hjerte og hjertet stykker med HBSS løsning. 3) hjertet brikkene må være helt lysed i en enkeltcelle suspensjon collagenase løsning. 4) polysucrose og natrium diatrizoate gradient løsningen for separasj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet i deler av National Institutes of Health tilskudd HL-113281 og HL116205 til Paras Kumar Mishra.
Materials
| Mice | The Jackson laboratory, USA | Stock no. 000664 | |
| Antibodies: | |||
| OCT4- | Abcam | ab18976 (rabbit polyclonal) | OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| SOX2 | Abcam | ab97959 (rabbit polyclonal) | SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Nanog | Abcam | ab80892 (rabbit polyclonal) | Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Ki67 | Abcam | ab16667 (rabbit polyclonal) | Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Sca I | Millipore | AB4336 (rabbit polyclonal) | Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| NKX2-5 | Santa Cruz | sc-8697 (goat polyclonal) | NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| GATA4 | Abcam | ab84593 (rabbit polyclonal) | GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| MEF2C | Santa Cruz | sc-13268 (goat polyclonal) | MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Troponin I | Millipore | MAB1691 (mouse monoclonal) | Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Actinin | Millipore | MAB1682 (mouse monoclonal) | Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| ANP | Millipore | AB5490 (mouse polyclonal) | ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution |
| Alex Fluor-488 checken anti-rabbit | Life technology | Ref no. A21441 | |
| Alex Fluor-594 goat anti-rabbit | Life technology | Ref no. A11012 | |
| Alex Fluor-594 rabbit anti-goat | Life technology | Ref no. A11078 | |
| Alex Fluor-488 checken anti-mouse | Life technology | Ref no. A21200 | |
| Alex Fluor-594 checken anti-goat | Life technology | Ref no. A21468 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture medium: | |||
| CSC maintenance medium | Millipore | SCM101 | Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells |
| cardiomyocytes differentiation medium | Millipore | SCM102 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5546 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Isolation buffer: | |||
| polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077) | Sigma | 10771 | |
| HBSS | Gibco | 2018-03 | |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | |
| Dispase solution | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| PBS | LONZA | S1226 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermoscientific | A1110501 | |
| Other reagents: | |||
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Normal checken serum | Vector laboratory | S3000 | |
| DAPI solution | Applichem | A100,0010 | Dapi, working concentration-1 µg/mL |
| Trypan blue | Biorad | 145-0013 | |
| Trypsin | Sigma | T4049 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| Formaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | ACROS | Cas No. 900-293-1 | |
| Tween 20 | Fisher Sceintific | Lot No. 160170 | |
| Ethanol | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue culture materials: | |||
| 100 mm petri dish | Thermo Scientific | ||
| 6-well plate | Thermo Scientific | ||
| 24-well plate | Thermo Scientific | ||
| T-25 flask | Thermo Scientific | ||
| T-75 flask | Thermo Scientific | ||
| 15 ml conical tube | Thermo Scientific | ||
| 50 mL conical tube | Thermo Scientific | ||
| 40 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 100 µm cell stainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| 0.22 µm filter | Fisher Scientific | 09-719C | |
| 10 mL syring | BD | Ref no. 309604 | |
| 10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tips | Fisher Scientific | ||
| 5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipette | Thermo Scientific | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Centrufuge machine | Thermo Scientific | LEGEND X1R centrifuge | |
| EVOS microscope | Life technology | ||
| Automated cell counter | Biorad | ||
| Cell counting slide | Biorad | 145-0011 | |
| Pippte aid | Thermo Scientific | S1 pipet filler | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments: | |||
| Surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Fine surgical scissors | Fine Scientific Tool | ||
| Curve shank forceps | Fine Scientific Tool | ||
| Surgical blade | Fine Scientific Tool |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146 (2017).
- Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
- Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction – From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
- Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
- Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
- Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
- Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
- Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
- Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
- Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
- Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162 (2015).
- Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
- Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
- Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
- Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
- Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
- Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
- Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
- Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265 (2011).
- Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17 (2017).
- Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
- Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
- Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
- Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
- Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
- Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
- Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
- Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
- Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
- Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75 (2014).
- Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).
