في فيفو تصوير للأنواع الأكسجين التفاعلية في الفاري الجرح النموذجي
Summary
يصف لنا غير الغازية في فيفو التصوير البروتوكول تكون مبسطة وفعالة من حيث التكلفة، الاستفادة من L-012، تشيميلومينيسسينت لومينول النظير، تصور والتحديد الكمي للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) التي تم إنشاؤها في نموذج ماوس استئصالية الجرح.
Abstract
الجيل للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) السمة مميزة للعمليات التحريضية، ولكن في الزائدة، تورط الأكسدة على نطاق واسع في مختلف الأمراض مثل السرطان، وتصلب الشرايين والسكري. وقد أظهرنا سابقا أن الخلل الوظيفي للعامل النووي (المستمدة من محمر 2)-مثل 2 (Nrf2)/التئام المستمدة من الخلية محمر كيلتش مثل البروتين 1 (كياب1) مما يشير إلى مسار يؤدي إلى المدقع روس الخلل خلال الجلدي في مرض السكري. نظراً لمستويات روس مؤشرا هاما على تطور التئام الجروح، قيمة تقنيات القياس الكمي محددة ودقيقة. وقد وصفت عدة فحوصات في المختبر لقياس روس في الخلايا والأنسجة؛ ومع ذلك، أنها توفر فقط قياس تراكمي واحد كل عينة. في الآونة الأخيرة، ووضع مؤشرات تستند إلى البروتين وطرائق التصوير أتاحت تحليلات الزمانية المكانية فريدة من نوعها. L-012 (13ح ج8كلن4الحسابية2) هو مشتق لومينول التي يمكن استخدامها في فيفو و في المختبر تشيميلومينيسسينت الكشف عن روس التي تم إنشاؤها بواسطة نابده أوكسيديز. L-012 تنبعث إشارة أقوى من غيرها المسابير الفلورسنت، ولقد ثبت أن تكون حساسة وموثوق بها للكشف عن روس. انطباق L-012-يسرت تصوير مرور الوقت يوفر معلومات قيمة عن العمليات الالتهابية مع الحد من الحاجة إلى التضحية وخفض عدد الحيوانات الدراسة الشاملة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام L-012-يسرت في فيفو التصوير للتحديد الكمي للأكسدة في نموذج لالتئام استئصالية استخدام الفئران السكري مع اختلال محلياً Nrf2/Keap1.
Introduction
والايضات الأوكسجين التي تم إنشاؤها من خلال عمليات الالتهابات تساهم مختلف الشلالات إرسال الإشارات، فضلا عن التغيير المدمرة لمكونات الخلوية1. استخدام تقنيات حساسة ومحددة لقياس روس أمر بالغ الأهمية لدراسة العمليات التحريضية ووصف آثار الأكسدة. التصوير في فيفو قيمة بسبب قدرته على توفير البيانات المكانية والزمانية الحيوية في الأنسجة الحية. L-012 هو تحقيق تشيميلومينيسسينت اصطناعية التي هي حساسة للغاية لأكسيد فائق الأنيونات وينتج كثافة ضوء أعلى من غيرها المسابير الفلورسنت في الخلايا والأنسجة والدم كله1،2،3، 4-أنها استخدمت بنجاح للتصوير في فيفو في نماذج مورين لدراسة أمراض التهابات عدة، بما في ذلك التهاب المفاصل والتهاب القولون5،6. فما زال التي ستستخدم في جرحا جلدي المنشأة شفاء النموذجي. قياس روس إنشاؤها نفس القدر ذات الصلة لتقييم تطور التئام تحت ظروف مختلفة. حساسية وطبيعة موسع لهذا الأسلوب يجعل من تقنية واعدة لدراسة التئام عبر نماذج مورين.
Nrf2 محرك رئيسي للاستجابة المضادة للأكسدة وعامل النسخي مع خصوصية لمضادات الأكسدة استجابة العنصر (ARE) مشتركة في مناطق المروج العديد من الإنزيمات المضادة للأكسدة8. نظراً لغياب الأكسدة، هو المعزول Nrf2 في السيتوبلازم ب Keap1، الذي يسبب لاحقاً في أوبيكويتينيشن وتدهور. قد تورط في التوازن الأكسدة غير ملائمة، وتأخر التئام الجروح في الإعداد لزيادة الأكسدة9اختلال المسار Nrf2/Keap1. أظهرنا سابقا أن قمع Keap1 يحفز زيادة Nrf2 النشاط ويعزز الجروح الإنقاذ من التئام الجرح الجلدي باثولوجي في السكري9.
هنا يصف لنا هو بروتوكول يستخدم الإضاءة الحيوية ل-012-ساعد التصوير لقياس مستويات روس في نموذج شفاء الجروح جلدية استئصالية، هو أمر حاسم لتسليط الضوء على الرابطة بين روس والتئام الجروح. هذا الأسلوب يوضح التغييرات في الوقت الحقيقي في عبء الأكسدة داخل الجروح والمنطقة المحيطة مباشرة. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يسمح للتقييم السريع للتدخلات والآليات المناولة الأكسدة تؤثر على ذلك. هنا نستخدم نموذجا من كيب1 ضربة قاضية لاستعادة التوازن الأكسدة والاختزال لتقييم إمكانية تطبيق استراتيجيتنا. لأن لدينا تقنية غير الغازية والجروح بدون عائق، يمكن استخدام الحيوان نفسه لمزيد من التحليلات المؤكدة على أساس ليساتيس الخلايا أو الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب الشائعة لقياس روس حدت من البروتوكولات المعقدة التي تتطلب استخراج الأنسجة أو تقنيات الغازية وبالمثل. في السنوات الأخيرة، أبلغ عن قياسات للأكسدة على أساس أساليب التصوير المبتكرة، مما يسمح لتقييمات الزمانية المكانية9،،من1011. وقد L…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون “جوهر التصوير السريري” في “كلية الطب في جامعة نيويورك”، بخاصة بفضل اريستيزابال أورلاندو ويوسف الزعيم وادغيري. الأساسية مورد مشترك يدعمه جزئيا 5P30CA016087 لورا وإسحاق بيرلموتر السرطان مركز دعم المنح المعاهد الوطنية للصحة/NCI و NIBIB الطبية تكنولوجيا الموارد مركز منح المعاهد الوطنية للصحة P41 EB017183. هذا العمل كان تدعمها الرابطة الأمريكية لمرض السكري “الطريق لوقف مرض السكري” إلى العاصمة [منحة رقم 1-16-آيس-08] وجامعة نيويورك تطبق صندوق دعم البحوث للعلاقات العامة
Materials
| BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J mice | Jackson Laboratories | 000642 | |
| 13 cm x 18 cm Silicone sheet (0.6 mm) | Sigma Aldrich | 665581 | |
| 3M Tegaderm Transparent Film Dressings | 3M | 88-1626W | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technologies | 11668027 | |
| Keap1 Stealth siRNA | Thermofisher Scientific | 1299001 | |
| Silencer negative control | Thermofisher Scientific | AM4635 | |
| Opti-MEM Reduced Serum | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14040133 | |
| Methyl-cellulose | Sigma Aldrich | 9004-67-5 | |
| L-012 | Wako Chemicals | 120-04891 | |
| IVIS Lumina III XR In Vivo Imaging System | PerkinElmer |
References
- Nishinaka, Y., et al. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Daiber, A., et al. Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012. Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).
- Imada, I., et al. Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012. Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).
- Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012. Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).
- Fuchs, K., et al. In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation. The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).
- Asghar, M. N., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis. Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t., Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).
- Soares, M. A., et al. Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche. Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).
- Wang, X., et al. Imaging ROS signaling in cells and animals. Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).
- Kielland, A., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).
- Balke, J., et al. Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging. Small. , (2018).
- Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation. Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Rabbani, P. S., et al. Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds. Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).
- Rabbani, P. S., et al. Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing. Biomaterials. 132, 1-15 (2017).
